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生物化學與分子生物學/RNA實驗技術/RNA瓊脂糖凝膠電泳

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實驗目的[編輯]

掌握植物總RNA非變性膠電泳的原理和方法。

實驗原理[編輯]

RNA電泳可以在變性及非變性兩種條件下進行。非變性電泳使用1.0%--1.4%的凝膠,不同的RNA條帶也能分開,但無法判斷其分子量。只有在完全變性的條件下,RNA的泳動率才與分子量的對數呈線性關係。因此要測定RNA分子量時,一定要用變性凝膠。在需快速檢測所提總RNA樣品完整性時,配製普通的1%瓊脂糖凝膠即可。

實驗材料、器具及藥品[編輯]

蘑菇的總RNA溶液。 電泳儀,電泳槽,電子天平,移液器,槍頭,微波爐,紫外透射檢測儀等。 瓊脂糖,1XTAE電泳緩衝液,0.5μg/ml溴化乙錠(EB)10X載樣緩衝液。

實驗步驟[編輯]

  1. 用1×TAE電泳緩衝液製作瓊脂糖凝膠,加1×TAE電泳緩衝液至液面覆蓋凝膠。
  2. 在超淨工作檯上,用移液器吸取總RNA樣品4μl於封口膜上。在實驗台上再加入5μl 1×TAE電泳緩衝液及1μl 的10X載樣緩衝液,混勻後,小心加入點樣孔。
  3. 打開電源開關,調節電壓至100V,使RNA由負極向正極電泳,約30min後將凝膠放入EB染液中染色5min,用清水稍微漂洗。在紫外透射檢測儀上觀察RNA電泳結果。

RNA的變性瓊脂糖凝膠檢測[編輯]

試劑[編輯]

  1. MOPS緩衝液(10*):0.4mol/L 嗎啉代丙烷磺酸(MOPS) (Ph7.0),0.1mol/L NaAc, 10mol/L EDTA。
  2. 上樣染料:50%甘油,1mmol/L EDTA ,0.4%溴酚藍,0.4%二甲苯藍。
  3. 甲醛。
  4. 去離子甲醯胺。v電泳槽清洗:去污劑洗乾淨(一般浸泡過夜)——水沖洗——乙醇乾燥——3%H2O2灌滿——室溫放置10分鐘——0.1%DEPC水沖洗。

操作[編輯]

  1. 將制膠用具用70%乙醇沖冼一遍,晾乾備用。
  2. 配製瓊脂糖凝膠。
    • ①稱取0.5g瓊脂糖,置乾淨的100ml 錐形瓶中,加入40ml蒸餾水,微波爐內加熱使瓊脂糖徹底溶化均勻。
    • ②待膠涼至60--70 ℃,依次向其中加入9ml 甲醛、5ml 10X MOPS緩衝液和0.5ul 溴化乙錠,混合均勻。
    • ③灌制瓊脂糖凝膠。

樣品準備:[編輯]

  • ① 取 DEPC處理過的500ul小離心管,依次加入如下試劑: 10x MOPS緩衝液2ul,甲醛3.5ul,甲醯胺(去離子)10ul,RNA 樣品 4.5ul,混勻。
  • ② 將離心管置於60℃水浴中保10分鐘,再置冰上2分鐘。
  • ③ 向管中加入3ul 上樣染料,混勻。

上樣[編輯]

電泳[編輯]

電泳槽內加入1XMOPS緩衝液,於7.5V/ml 的電壓下電泳。

電泳結束後,在紫外燈下檢查結果。