生物化学与分子生物学/PCR实验技术/ddRT-PCR操作步骤
mRNA差别显示技术也称为差示反转录 PCR（Differential Display of reverse Transcriptional PCR）简称为ddRT-PCR。它是将 mRNA反转录技术与PCR技术二者相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术。
目前已广泛应用于分离鉴定组织特异性表达的基因。差别基因表达（differential gene express）是细胞分化的基础。mRNA 差别显示技术正是对组织特异性表达的基因进行分离的一种快速而行之有效的方法。该方法的基本原理是首先选取不同的组织样品或不同发育阶段的同一组织样品或同一组织样品经不同药物处理诱导的样品，经总RNA提取后，进行mRNA反转录合成cDNA。
此cDNA的合成是采用Oligo（dT）12 MN为引物，其中M为A，C，G中的任意一种，N为A，C，G或T中的任意一种，所以共有12种 oligo（dT）12 MN引物，其中M称为锚定碱基，起增大引物Tm值的作用，N称为分类碱基，对反转录进行分类。用这12种引物分别对同一总RNA 样品进行cDNA合成，即进行12次不同的反转录反应，从而使反转录的cDNA具有12种类型，也就是对cDNA进行12种归类（目前较为流行的方法是进行4种归类，即M为简并碱基的形式存在），在此基础上对每一类cDNA进行随机引物和反转录引物PCR扩增，通过对组织样品的同一类cDNA的PCR选择性扩增产物凝胶电泳分析，从而反映出不同样品间基因的时间和空间上组织特异性的表达。
如此众多种类的mRNA反转录产物经PCR选择扩增后其类型依然为数众多，很难用电泳系统加以快速准确地分离。因而需要对反转录产物cDNA进行归类处理，减轻不同PCR产物电泳分离的难度，提高分离的准确率。
实验流程
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这里以CLONTECH公司生产的DeltaTM Differential Display Kit为例，介绍具体的实验步骤。该试剂盒中含有10种任意引物和9种Oligo(dT)引物。
操作步骤
[编辑]总RNA的提取（见Northern 杂交）
[编辑]第一链合成：
[编辑]- 总RNA样品 2μg；cDNA合成引物 1μl；加ddH2O补至5μl。将管标号为1A,2A,PC A等。PC为阳性对照。
- 混匀后稍离心。
- 70℃孵育3min，冰浴2min后稍离心。
- 准备dNTP mix (以5管为例 )
- 每管加入5μl，混匀后稍离心。
- 42℃孵育1hr。
- 75℃ 10min终止反应后置冰上，稍离心。
- 将 2μl反应液分别转至新管中（新管标号为1B,2B,PC B等）。
- 将78μl ddH2O分别加入B管中,混匀。
- 将72μl ddH2O分别加入A管中，混匀。
- 所有cDNA稀释液 -20℃保存待用。
dd-PCR: 以 引物 P1,T9为例说明
[编辑]| 管号 | cDNA样品 | 引物 |
|---|---|---|
| 1 | 1A | P1,T9 |
| 2 | 1B | P1,T9 |
| 3 | 2A | P1,T9 |
| 4 | 2B | P1,T9 |
| 5 | H2O | P1,T9 |
| 6 | RNA1 | P1,T9 |
| 7 | RNA2 | P1,T9 |
| 以下为阳性对照反应体系 | ||
| 8 | PC 1A | P10,T8 |
| 9 | PC 1B | P10,T8 |
| 10 | PC 2A | P10,T8 |
| 11 | PC 2B | P10,T8 |
| 12 | H2O | P10,T8 |
| 13 | PC RNA1 | P10,T8 |
| 14 | PC RNA2 | P10,T8 |
在PCR 管中加入:
| cDNA样品 | 1μl |
| P引物 | 1μl |
| T引物 | 1μl |
| 混匀后稍离心。 | |
准备其他PCR试剂的混合液：（在另一管中加入）
| 成分 | 每管(μl) | 所需管数（n=14） |
|---|---|---|
| 10xbuffer | 2.0 | 2n |
| ddH2O | 14.0 | 14n |
| dNTPmix | 0.2 | 0.2n |
| α-32P dATPν | 0.4 | 0.4n |
| Taq酶 | 0.4 | 0.4n |
| 终体积 | 17.0 | 17n |
将17μlPCR混合液加入各反应管，则各管总体积为20μl。
开始PCR扩增。
PCR循环参数
[编辑]在GeneAmp PCR Systems 2400 & 9600 扩增仪上执行以下程序：
| 1 cycles | 94°C 5min |
| 40°C 5min | |
| 68°C 5min | |
| 2 cycles | 94°C 30sec |
| 40°C 30sec | |
| 68°C 5min | |
| 23 cycles | 94°C 20sec |
| 40°C 30sec | |
| 68°C 2min | |
| 1 cycles | 68°C 7min |
反应结束后置-20℃保存备用。
电泳和放射自显影
[编辑]- 配制6%变性聚丙烯酰胺凝胶，灌注测序板。
- 预电泳 30min。
- 每个dd-PCR反应取出5μl于一新微量离心管中，加5μl loading buffer，混匀，离心，置94℃变性2min。立即置冰浴。
- 停止预电泳，冲洗加样孔。
- 加样2μl。70W电泳2.75hr至二甲苯青到达胶的底部。
- 下胶：（同测序胶）
- 干胶：在胶表面覆上保鲜膜，80℃干胶30min。
- X光片-70℃曝光过夜或更长时间(根据射线强度而定)。
差异条带回收再扩增
[编辑]- X光片经D72 显影、酸性定影液定影后，水洗晾干。置X光片灯上比较寻找差异条带。
- 用一次性手术刀片在胶上切割差异条带，加ddH2O 20μl，沸水浴15min，离心取上清为模板。
- 以原引物扩增：
| 回收 DNA | 7 μl |
| 10×PCR buffer | 5 μl |
| 5mM dNTPmix | 0.5 μl |
| 引物P | 2.5 μl |
| 引物T | 2.5 μl |
| Taq 酶 | 2 μl |
| 加ddH2O至总体积为50μl | |
- 执行PCR程序: 93℃3min；93℃1min→60℃1min→68℃2min，20次循环；68℃5min。
- 取 PCR产物10μl 2%琼脂糖电泳检测。
- PCR产物乙醇沉淀，10μlddH2O溶解。