生物化學與分子生物學/PCR實驗技術/ddRT-PCR操作步驟
mRNA差別顯示技術也稱為差示反轉錄 PCR（Differential Display of reverse Transcriptional PCR）簡稱為ddRT-PCR。它是將 mRNA反轉錄技術與PCR技術二者相互結合發展起來的一種RNA指紋圖譜技術。
目前已廣泛應用於分離鑑定組織特異性表達的基因。差別基因表達（differential gene express）是細胞分化的基礎。mRNA 差別顯示技術正是對組織特異性表達的基因進行分離的一種快速而行之有效的方法。該方法的基本原理是首先選取不同的組織樣品或不同發育階段的同一組織樣品或同一組織樣品經不同藥物處理誘導的樣品，經總RNA提取後，進行mRNA反轉錄合成cDNA。
此cDNA的合成是採用Oligo（dT）12 MN為引物，其中M為A，C，G中的任意一種，N為A，C，G或T中的任意一種，所以共有12種 oligo（dT）12 MN引物，其中M稱為錨定鹼基，起增大引物Tm值的作用，N稱為分類鹼基，對反轉錄進行分類。用這12種引物分別對同一總RNA 樣品進行cDNA合成，即進行12次不同的反轉錄反應，從而使反轉錄的cDNA具有12種類型，也就是對cDNA進行12種歸類（目前較為流行的方法是進行4種歸類，即M為簡併鹼基的形式存在），在此基礎上對每一類cDNA進行隨機引物和反轉錄引物PCR擴增，通過對組織樣品的同一類cDNA的PCR選擇性擴增產物凝膠電泳分析，從而反映出不同樣品間基因的時間和空間上組織特異性的表達。
如此眾多種類的mRNA反轉錄產物經PCR選擇擴增後其類型依然為數眾多，很難用電泳系統加以快速準確地分離。因而需要對反轉錄產物cDNA進行歸類處理，減輕不同PCR產物電泳分離的難度，提高分離的準確率。
實驗流程
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這裏以CLONTECH公司生產的DeltaTM Differential Display Kit為例，介紹具體的實驗步驟。該試劑盒中含有10種任意引物和9種Oligo(dT)引物。
操作步驟
[編輯]總RNA的提取（見Northern 雜交）
[編輯]第一鏈合成：
[編輯]- 總RNA樣品 2μg；cDNA合成引物 1μl；加ddH2O補至5μl。將管標號為1A,2A,PC A等。PC為陽性對照。
- 混勻後稍離心。
- 70℃孵育3min，冰浴2min後稍離心。
- 準備dNTP mix (以5管為例 )
- 每管加入5μl，混勻後稍離心。
- 42℃孵育1hr。
- 75℃ 10min終止反應後置冰上，稍離心。
- 將 2μl反應液分別轉至新管中（新管標號為1B,2B,PC B等）。
- 將78μl ddH2O分別加入B管中,混勻。
- 將72μl ddH2O分別加入A管中，混勻。
- 所有cDNA稀釋液 -20℃保存待用。
dd-PCR: 以 引物 P1,T9為例說明
[編輯]| 管號 | cDNA樣品 | 引物 |
|---|---|---|
| 1 | 1A | P1,T9 |
| 2 | 1B | P1,T9 |
| 3 | 2A | P1,T9 |
| 4 | 2B | P1,T9 |
| 5 | H2O | P1,T9 |
| 6 | RNA1 | P1,T9 |
| 7 | RNA2 | P1,T9 |
| 以下為陽性對照反應體系 | ||
| 8 | PC 1A | P10,T8 |
| 9 | PC 1B | P10,T8 |
| 10 | PC 2A | P10,T8 |
| 11 | PC 2B | P10,T8 |
| 12 | H2O | P10,T8 |
| 13 | PC RNA1 | P10,T8 |
| 14 | PC RNA2 | P10,T8 |
在PCR 管中加入:
| cDNA樣品 | 1μl |
| P引物 | 1μl |
| T引物 | 1μl |
| 混勻後稍離心。 | |
準備其他PCR試劑的混合液：（在另一管中加入）
| 成分 | 每管(μl) | 所需管數（n=14） |
|---|---|---|
| 10xbuffer | 2.0 | 2n |
| ddH2O | 14.0 | 14n |
| dNTPmix | 0.2 | 0.2n |
| α-32P dATPν | 0.4 | 0.4n |
| Taq酶 | 0.4 | 0.4n |
| 終體積 | 17.0 | 17n |
將17μlPCR混合液加入各反應管，則各管總體積為20μl。
開始PCR擴增。
PCR循環參數
[編輯]在GeneAmp PCR Systems 2400 & 9600 擴增儀上執行以下程序：
| 1 cycles | 94°C 5min |
| 40°C 5min | |
| 68°C 5min | |
| 2 cycles | 94°C 30sec |
| 40°C 30sec | |
| 68°C 5min | |
| 23 cycles | 94°C 20sec |
| 40°C 30sec | |
| 68°C 2min | |
| 1 cycles | 68°C 7min |
反應結束後置-20℃保存備用。
電泳和放射自顯影
[編輯]- 配製6%變性聚丙烯醯胺凝膠，灌注測序板。
- 預電泳 30min。
- 每個dd-PCR反應取出5μl於一新微量離心管中，加5μl loading buffer，混勻，離心，置94℃變性2min。立即置冰浴。
- 停止預電泳，沖洗加樣孔。
- 加樣2μl。70W電泳2.75hr至二甲苯青到達膠的底部。
- 下膠：（同測序膠）
- 干膠：在膠表面覆上保鮮膜，80℃干膠30min。
- X光片-70℃曝光過夜或更長時間(根據射線強度而定)。
差異條帶回收再擴增
[編輯]- X光片經D72 顯影、酸性定影液定影后，水洗晾乾。置X光片燈上比較尋找差異條帶。
- 用一次性手術刀片在膠上切割差異條帶，加ddH2O 20μl，沸水浴15min，離心取上清為模板。
- 以原引物擴增：
| 回收 DNA | 7 μl |
| 10×PCR buffer | 5 μl |
| 5mM dNTPmix | 0.5 μl |
| 引物P | 2.5 μl |
| 引物T | 2.5 μl |
| Taq 酶 | 2 μl |
| 加ddH2O至總體積為50μl | |
- 執行PCR程序: 93℃3min；93℃1min→60℃1min→68℃2min，20次循環；68℃5min。
- 取 PCR產物10μl 2%瓊脂糖電泳檢測。
- PCR產物乙醇沉澱，10μlddH2O溶解。