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生物化学与分子生物学/PCR实验技术/touchdown-PCR

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降落PCR(touchdown PCR),一种PCR技术,主要用于PCR的条件的优化。在许多情况下引物的设计使得PCR难以进行,例如特异性不够易错配等。退火温度过高会使PCR效率过低,但退火温度过低则会使非特异扩增过多。

实验材料:基因样品

仪器、耗材:PCR仪

实验步骤:

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  1. 反应体积为50 μl。
  2. 人CD137胞膜外区基因的PCR扩增体系:CD137-pCDNA3质粒4 μl,P1,P2各0.5 μmol/L,MgCl2 2 mmol/L,dNTP 0.4 mmol/L,Taq 5 U。
  3. hIgG1Fc片段的PCR扩增体系:含人hIgG1Fc的PGEM-T质粒4 μl,P3、P4各0.4 μmol/L,MgCl2 2 mmol/L,dNTP 0.4 mmol/L,Taq 5 U。
  4. HBVDNA多聚酶基因的PCR扩增体系:
    • 第一轮:HBVDNA模板4 μl,P5、P6各0.25 μmol/L,MgCl2 1.5 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,Taq 0.8 U.
    • 第二轮:取5倍稀释的第一轮PCR产物4μl为模板,P7、P8各0.25 μmol/L,MgCl2 1.5 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,Taq 0.8 U。
  5. 分别在各灭菌PCR管加入上述各反应成分,100℃煮沸5 min,立即冰浴5 min,加入TaqDNA聚合酶,混匀,离心,PCR程序如下:
    • 94度预变性5分钟,
    • 94度变性30秒,62度(Tm若为55度)退火30秒,72度延伸1分钟。
    • 以后每2个循环依次降低退火温度2度,直到50度,共15个循环。
    • 94度变性30秒,50度退火30秒,72度延伸1分钟。
    • 15-20个循环后。
    • 72度延伸5分钟。
  6. 取 10 μl PCR 扩增产物,在2%或3%琼脂糖凝胶上电泳,紫外灯下观察扩增产物。

注意事项:

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由于目标是在较早的循环中避免低Tm值配对,在TD—PCR中最好应用热启动技术。设计时,退火温度的范围应跨越15℃左右,从高于估计Tm值至少几度到低于它10℃