生物化學與分子生物學/PCR實驗技術/touchdown-PCR

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降落PCR(touchdown PCR),一種PCR技術,主要用於PCR的條件的優化。在許多情況下引物的設計使得PCR難以進行,例如特異性不夠易錯配等。退火溫度過高會使PCR效率過低,但退火溫度過低則會使非特異擴增過多。

實驗材料:基因樣品

儀器、耗材:PCR儀

實驗步驟:[編輯]

  1. 反應體積為50 μl。
  2. 人CD137胞膜外區基因的PCR擴增體系:CD137-pCDNA3質粒4 μl,P1,P2各0.5 μmol/L,MgCl2 2 mmol/L,dNTP 0.4 mmol/L,Taq 5 U。
  3. hIgG1Fc片段的PCR擴增體系:含人hIgG1Fc的PGEM-T質粒4 μl,P3、P4各0.4 μmol/L,MgCl2 2 mmol/L,dNTP 0.4 mmol/L,Taq 5 U。
  4. HBVDNA多聚酶基因的PCR擴增體系:
    • 第一輪:HBVDNA模板4 μl,P5、P6各0.25 μmol/L,MgCl2 1.5 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,Taq 0.8 U.
    • 第二輪:取5倍稀釋的第一輪PCR產物4μl為模板,P7、P8各0.25 μmol/L,MgCl2 1.5 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,Taq 0.8 U。
  5. 分別在各滅菌PCR管加入上述各反應成分,100℃煮沸5 min,立即冰浴5 min,加入TaqDNA聚合酶,混勻,離心,PCR程序如下:
    • 94度預變性5分鐘,
    • 94度變性30秒,62度(Tm若為55度)退火30秒,72度延伸1分鐘。
    • 以後每2個循環依次降低退火溫度2度,直到50度,共15個循環。
    • 94度變性30秒,50度退火30秒,72度延伸1分鐘。
    • 15-20個循環後。
    • 72度延伸5分鐘。
  6. 取 10 μl PCR 擴增產物,在2%或3%瓊脂糖凝膠上電泳,紫外燈下觀察擴增產物。

注意事項:[編輯]

由於目標是在較早的循環中避免低Tm值配對,在TD—PCR中最好應用熱啟動技術。設計時,退火溫度的範圍應跨越15℃左右,從高於估計Tm值至少幾度到低於它10℃