生物化學與分子生物學/其他實驗技術/原位雜交實驗

探針的設計與合成

根據實驗室已有的p8基因cDNA全長序列，用premier primer5.0設計引物p81和p82，以鹵蟲cDNA為模板，PCR擴增得到346bp的產物，用Takara膠回收試劑盒回收純化。

引物編號	引物序列	長度
p81	TGCGGACGAAACAGGAAG	18 bp
p82	GCTCAAACAGTGATGCCAGT	20 bp

目的片段克隆

a. 在無菌離心管中加入連接載體的各種成分，載體與片段的摩爾比控制在1:3-1:8，根據凝膠電泳檢測後的濃度及載體與片段分子大小來計算摩爾比。加入成分及比例如下：

目的PCR片段	5 μl
pGM-T載體（約50ng/uL）	1 μl
10×T4 DNA Ligation Buffer	1 μl
T4 DNA Ligase（3U/uL）	1 μl
無菌去離子水	3 μl
總體積	10 μl

b. 輕輕彈動離心管以混合內容物，短暫離心。置於PCR儀中16℃過夜連接，反應結束後將離心管置於冰上。

c. 向鋪好的含有氨苄青黴素的固體平板表面加入16 μl的IPTG（50mg/ml）、40 μl的X-gal（20mg/ml），使用無菌的彎頭玻璃棒將其均勻的塗開，避光置於37℃培養箱1-3小時，使溶解X-gal的二甲基甲醯揮發乾淨。

d. 將10 μl的連接產物加到100 μl DH5α感受態細胞中，輕彈混勻，冰浴半小時，將離心管置於42℃水浴90秒，取出管後立即置於冰浴上放置2-3分鐘，其間不要搖動離心管。向離心管加入500 μl 37℃預熱的LB（不含抗生素）培養基，150rpm搖床37℃振盪培養45分鐘。目的是使質粒上相關的抗性標記基因表達，使菌體復甦。將菌液於4000g下離心10分鐘，去掉上清，加入100 μl培養液重溶並加入到配製好的LB固體培養基上，用無菌的彎頭玻璃棒輕輕將細胞均勻塗開。待平板表面乾燥後，倒置平板，37℃培養12-16小時。

e. 挑取白色菌落直接進行PCR檢測，篩選轉化子。

f. 將轉化子接種於LB液體培養基中培養24小時，吸取1mL菌液送至大連寶生物公司進行序列測序。

重組質粒的線性化

取6 μl以測序的重組質粒，選取NcoI內切酶37℃酶切4h。酶切反應體系為20 μl：

質粒 6 μl

10xK Buffer 2 μl

NcoI酶 1 μl

0.1% BSA 2 μl

滅菌水 9 μl

終體積 20 μl

取酶切前後的質粒各4 μl，經1%瓊脂糖電泳檢測，確認酶切完全，將酶切產物用Takara膠回收試劑盒回收純化，作為探針合成的模板。

探針合成

按羅氏DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)試劑盒使用指南，標記反義RNA探針。

使用的所有試劑和器皿均經去RNase處理，合成方法如下:先準備反應體系。冰上向RNase-Free的微離心管中順序加入下列試劑:

純化的線形質粒	1 μg
Rnase-free dH2O	up to 13 μl
10xNTP labeling mixture	2 μl
10xTranscription buffer	2 μl
Rnase inhibitor	1 μl
SP6 RNA Polymerase	2 μl
總體積	20 μl

稍混勻，短暫離心將反應液集於管底，37℃ 2 h。反應結束後再補加2 μl DNase I，37℃ 15 min，反應結束後加入0.2M EDTA 2 μl 終止反應。取3-5 μl 反應產物1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。-20℃保存備用。

石蠟切片的製備

本實驗在雜交結束前均必須保證RNase-free.玻璃器皿採用180℃烘烤10小時。其它採用DEPC處理，高溫滅菌鍋高溫降解DEPC。若儀器不能高溫處理，可用3%的H2O2處理半小時以上，DEPC水沖洗乾淨，烘乾。

組織的固定與包埋

選取不同發育時期（0h，5h，10h，15h，20h，40h，3d，5d，7d）的鹵蟲，經DEPC處理水沖洗表面鹽分後，加入新鮮配製的4%多聚甲醛，於4℃固定5-8 h，再分別按下列順序進行脫水、透明和包埋: 30%乙醇脫水1 h，50%乙醇脫水1 h，70%乙醇脫水1 h，80%乙醇脫水乙醇脫水1 h，90%乙醇脫水1 h，無水乙醇脫水1 h，無水乙醇脫水1 h，無水乙醇:二甲苯(1:l)透明10 min，二甲苯透明10 min、二甲苯:54℃石蠟(1:1)浸蠟30 min，54℃石蠟浸蠟1 h，54℃石蠟包埋。

組織切片

將包埋的組織按7 μm的厚度切片，在多聚賴氨酸處理的載玻片上滴加DEPC處理水，組織片於42℃展片台上展片1小時，再置於40℃恆溫箱中烘片12小時後放於4℃密封保存備用。

雜交前處理

切片經二甲苯脫蠟2×15 min，無水乙醇:二甲苯(1:l) 5 min，100%-95%-80%-50%-30%乙醇脫水各5 min，後DEPC處理水2×5 min，然後進行雜交前切片處理，具體步驟如下:

lxPBS(pH7.4)室溫孵育2x5 min。
0.3%TtitonX-100的PBS中去膜處理15 min。
lxPBS洗滌2x5 min。
無RNase的蛋白酶K(20 μg/mL)37℃消化30 min。
100mMGly/PBS中洗2x5 min。
lxPBS洗滌2x5 min。
4%多聚甲醛(4℃)固定5min。
lxPBS洗滌2x5 min。
含有0.25%(W/v)的乙酸酐的100mM的三乙醇胺緩衝液(pH8.0)去電荷處理15 min(現配現用)。
lxPBS洗滌2x5 min。

預雜交和雜交

滴加預雜交液於載玻片上，然後置於濕盒中，50℃預雜交2小時。
棄去預雜交液，立即滴加雜交液，置於濕盒中52℃雜交過夜。

雜交後處理

雜交完，以後的步驟不必要特意防RNA酶。

棄去雜交液，載片浸入2xSSC中2x15 min。
載片浸入1xSSC中55℃水浴搖動2x15 min。
用含20μg/mL的RNaseA的NTE緩衝液37℃消化30分鐘，以去除未結合的探針。
載片浸入0.5xSSC中55℃水浴搖動2x15 min。
載片浸入0.5xSSC中室溫10 min。

抗體反應

用washing buffer清洗組織片5 min。
滴加封閉液緩衝液室溫下處理組織片30 min。
用抗體液覆蓋封閉後的組織片，置於濕盒中孵育3h以上。
Washing buffer 洗2x15 min。
Detection buffer 中平衡2-5 min。

顯色

加入顯色液於濕盒中黑暗靜止顯色16h

封片與觀察

顯色合適時，用TE buffer終止着色反應，再用蒸餾水清洗。
滴加封片劑封片，顯微鏡下觀察和攝影。