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生物化學與分子生物學/其他實驗技術/原位雜交實驗

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探針的設計與合成[編輯]

根據實驗室已有的p8基因cDNA全長序列,用premier primer5.0設計引物p81和p82,以鹵蟲cDNA為模板,PCR擴增得到346bp的產物,用Takara膠回收試劑盒回收純化。

引物編號 引物序列 長度
p81 TGCGGACGAAACAGGAAG 18 bp
p82 GCTCAAACAGTGATGCCAGT 20 bp

目的片段克隆[編輯]

a. 在無菌離心管中加入連接載體的各種成分,載體與片段的摩爾比控制在1:3-1:8,根據凝膠電泳檢測後的濃度及載體與片段分子大小來計算摩爾比。加入成分及比例如下:

目的PCR片段 5 μl
pGM-T載體(約50ng/uL) 1 μl
10×T4 DNA Ligation Buffer 1 μl
T4 DNA Ligase(3U/uL) 1 μl
無菌去離子水 3 μl
總體積 10 μl

b. 輕輕彈動離心管以混合內容物,短暫離心。置於PCR儀中16℃過夜連接,反應結束後將離心管置於冰上。

c. 向鋪好的含有氨苄青黴素的固體平板表面加入16 μl的IPTG(50mg/ml)、40 μl的X-gal(20mg/ml),使用無菌的彎頭玻璃棒將其均勻的塗開,避光置於37℃培養箱1-3小時,使溶解X-gal的二甲基甲醯揮發乾淨。

d. 將10 μl的連接產物加到100 μl DH5α感受態細胞中,輕彈混勻,冰浴半小時,將離心管置於42℃水浴90秒,取出管後立即置於冰浴上放置2-3分鐘,其間不要搖動離心管。向離心管加入500 μl 37℃預熱的LB(不含抗生素)培養基,150rpm搖床37℃振盪培養45分鐘。目的是使質體上相關的抗性標記基因表達,使菌體復甦。將菌液於4000g下離心10分鐘,去掉上清,加入100 μl培養液重溶並加入到配製好的LB固體培養基上,用無菌的彎頭玻璃棒輕輕將細胞均勻塗開。待平板表面乾燥後,倒置平板,37℃培養12-16小時。

e. 挑取白色菌落直接進行PCR檢測,篩選轉化子。

f. 將轉化子接種於LB液體培養基中培養24小時,吸取1mL菌液送至大連寶生物公司進行序列測序。

重組質體的線性化[編輯]

取6 μl以測序的重組質體,選取NcoI內切酶37℃酶切4h。酶切反應體系為20 μl:

質體            6 μl

10xK Buffer      2 μl

NcoI酶          1 μl

0.1% BSA        2 μl

滅菌水          9 μl

終體積          20 μl

取酶切前後的質體各4 μl,經1%瓊脂糖電泳檢測,確認酶切完全,將酶切產物用Takara膠回收試劑盒回收純化,作為探針合成的模板。

探針合成[編輯]

按羅氏DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)試劑盒使用指南,標記反義RNA探針。

使用的所有試劑和器皿均經去RNase處理,合成方法如下:先準備反應體系。冰上向RNase-Free的微離心管中順序加入下列試劑:

純化的線形質體 1 μg
Rnase-free dH2O up to 13 μl
10xNTP labeling mixture 2 μl
10xTranscription buffer 2 μl
Rnase inhibitor 1 μl
SP6 RNA Polymerase 2 μl
總體積 20 μl

稍混勻,短暫離心將反應液集於管底,37℃ 2 h。反應結束後再補加2 μl DNase I,37℃ 15 min,反應結束後加入0.2M EDTA 2 μl 終止反應。取3-5 μl 反應產物1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。-20℃保存備用。

石蠟切片的製備[編輯]

本實驗在雜交結束前均必須保證RNase-free.玻璃器皿採用180℃烘烤10小時。其它採用DEPC處理,高溫滅菌鍋高溫降解DEPC。若儀器不能高溫處理,可用3%的H2O2處理半小時以上,DEPC水沖洗乾淨,烘乾。

組織的固定與包埋[編輯]

選取不同發育時期(0h,5h,10h,15h,20h,40h,3d,5d,7d)的鹵蟲,經DEPC處理水沖洗表面鹽分後,加入新鮮配製的4%多聚甲醛,於4℃固定5-8 h,再分別按下列順序進行脫水、透明和包埋: 30%乙醇脫水1 h,50%乙醇脫水1 h,70%乙醇脫水1 h,80%乙醇脫水乙醇脫水1 h,90%乙醇脫水1 h,無水乙醇脫水1 h,無水乙醇脫水1 h,無水乙醇:二甲苯(1:l)透明10 min,二甲苯透明10 min、二甲苯:54℃石蠟(1:1)浸蠟30 min,54℃石蠟浸蠟1 h,54℃石蠟包埋。

組織切片[編輯]

將包埋的組織按7 μm的厚度切片,在多聚賴氨酸處理的載玻片上滴加DEPC處理水,組織片於42℃展片台上展片1小時,再置於40℃恆溫箱中烘片12小時後放於4℃密封保存備用。

雜交前處理[編輯]

切片經二甲苯脫蠟2×15 min,無水乙醇:二甲苯(1:l) 5 min,100%-95%-80%-50%-30%乙醇脫水各5 min,後DEPC處理水2×5 min,然後進行雜交前切片處理,具體步驟如下:

  1. lxPBS(pH7.4)室溫孵育2x5 min。
  2. 0.3%TtitonX-100的PBS中去膜處理15 min。
  3. lxPBS洗滌2x5 min。
  4. 無RNase的蛋白酶K(20 μg/mL)37℃消化30 min。
  5. 100mMGly/PBS中洗2x5 min。
  6. lxPBS洗滌2x5 min。
  7. 4%多聚甲醛(4℃)固定5min。
  8. lxPBS洗滌2x5 min。
  9. 含有0.25%(W/v)的乙酸酐的100mM的三乙醇胺緩衝液(pH8.0)去電荷處理15 min(現配現用)。
  10. lxPBS洗滌2x5 min。

預雜交和雜交[編輯]

  1. 滴加預雜交液於載玻片上,然後置於濕盒中,50℃預雜交2小時。
  2. 棄去預雜交液,立即滴加雜交液,置於濕盒中52℃雜交過夜。

雜交後處理[編輯]

雜交完,以後的步驟不必要特意防RNA酶。

  1. 棄去雜交液,載片浸入2xSSC中2x15 min。
  2. 載片浸入1xSSC中55℃水浴搖動2x15 min。
  3. 用含20μg/mL的RNaseA的NTE緩衝液37℃消化30分鐘,以去除未結合的探針。
  4. 載片浸入0.5xSSC中55℃水浴搖動2x15 min。
  5. 載片浸入0.5xSSC中室溫10 min。

抗體反應[編輯]

  1. 用washing buffer清洗組織片5 min。
  2. 滴加封閉液緩衝液室溫下處理組織片30 min。
  3. 用抗體液覆蓋封閉後的組織片,置於濕盒中孵育3h以上。
  4. Washing buffer 洗2x15 min。
  5. Detection buffer 中平衡2-5 min。

顯色[編輯]

加入顯色液於濕盒中黑暗靜止顯色16h

封片與觀察[編輯]

  1. 顯色合適時,用TE buffer終止着色反應,再用蒸餾水清洗。
  2. 滴加封片劑封片,顯微鏡下觀察和攝影。