生物化學與分子生物學/蛋白質實驗技術/雙向電泳操作步驟及相關試劑配製
實驗原理
[編輯]2-DE的第一向電泳等電聚焦是基於等電點不同而將蛋白粗步分離，第二向SDS-PAGE是基於蛋白質分子量不同，而將一向分離後的蛋白進一步分離。這樣就可以得到蛋白質等電點和分子量的信息。
實驗步驟
[編輯]樣品的溶解
[編輯]取純化後的晶體蛋白3.0mg，加入300μl裂解液(1mg蛋白:100μl裂解液)振盪器上振盪10min左右，共處理一個小時。其中每隔10～15分鐘振盪一次，然後13200rpm離心15min除雜質，取上清分裝，每管70μl，—80℃保存。
Bradford法測蛋白含量
[編輯]取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超純水溶解,測定BSA標準曲線及樣品蛋白含量。
取7個10ml的離心管，首先在5個離心管中按次序加入0μl,5μl,10μl,15μl,20μl 的BSA溶解液，另2管中分別加入2μl的待測樣品溶液，再在每管中加入相應體積的雙蒸水（總體積為80μl），然後，各管中分別加入4ml的Bradford液（原來配好的Bradford液使用前需再取需要的劑量過濾一遍方能使用），搖勻，2min在595nm下，按由低到高的濃度順序測定各濃度BSA的OD值，再測樣品OD值。(測量過程要在一個小時內完成)。例如：
| 編號 | 蛋白量（ul） | Buffer(ul)Bradford(ml) | OD595值 |
| 1 | 0 | 4 | 0 |
| 2 | 5 | 4 | 0.024 |
| 3 | 10 | 4 | 0.061 |
| 4 | 15 | 4 | 0.091 |
| 5 | 20 | 4 | 0.116 |
Bt4 2 78 4 0.079
Bt4 4 76 4
轉Bt4 2 78 4 0.075
轉Bt4 4 76 4
標準曲線方程式：Y= aX+b.其中Y為 OD值，X為蛋白含量。a、b通過作圖輸入數據可知
相關係數通過輸入數據，作圖，軟件分析可得
OD值測量過程：
比色皿用70%的乙醇保存，待用時用雙蒸水沖洗，再用無水乙醇沖洗，雙蒸水沖洗，再加入待測樣品溶液潤洗，然後，加入樣品，測定OD值。
雙向電泳第一向---IEF（雙向電泳中一律使用超純水）
[編輯]水化液的製備
[編輯]稱取2.0mg 的DTT，用700μl水化液儲液溶解後,加入8μl 0.05% 的溴酚蘭，3.5μl（0.5%v/v）IPG buffer (pH 3-10)振盪混勻，13200rpm離心15min 除雜質，取上清。
在含300μg 蛋白（經驗值）的樣品溶解液中加入水化液，至終體積為340μl，振盪器上振盪混合,13200rpm離心15min除雜質，取上清。
點樣，上膠
[編輯]分兩次吸取樣品，每次170μl,按從正極到負極的順序加入點樣槽兩側，再用鑷子撥開Immobiline DryStrip gels (18cm，pH 3—10)膠條，從正極到負極將膠條壓入槽中,膠面接觸加入的樣品。注意：膠條使用前，要在室溫中平衡30分鐘；加樣時，正極要多加樣，以防氣泡的產生；壓膠時不能產生氣泡；酸性端對應正極，鹼性端對應負極；樣品加好後，加同樣多的覆蓋油(Bio-Rad)，兩個上樣槽必須與底線齊平。
IPG聚焦系統跑膠程序的設定（跑膠溫度為20℃）
[編輯]S1 (30v,12hr,360vhs,step)
S2 (500v,1hr,500vhs,step)
S3 (1000v,1hr,1000vhs,step)
S4 (8000v,0.5hr,2250vhs,Grad)
S5 (8000v,5hr,40000vhs,step)共計44110vhs,19.5小時
其中S1用於泡脹水化膠條，S2和S3用於去小離子，S4和S5用於聚焦。
平衡
[編輯]用鑷子夾出膠條,超純水沖洗後，在濾紙上吸乾（膠面，即接觸樣品那一面不能接觸濾紙，如果為18cm的膠條要將兩頭剪去），再以超純水沖洗，濾紙吸乾（再次沖洗過程也可省略），然後用鑷子夾住膠條以正極端（即酸性端）向下，負極端（即鹼性端）向上，放入用來平衡的試管中（鑷子所夾的是鹼性端，酸性端留有溴酚蘭作為標記），用平衡液A，平衡液B先後平衡15min。注:平衡時要注意保持膠面始終向上,不能接觸平衡管壁。
平衡第二次時，在沸水中煮Marker 3min,剪兩個同樣大小的小紙片，長度與一向膠條的寬度等同，然後吸取煮好的Marker，轉入SDS—PAGE膠面上，保持緊密貼合；同樣在第二次平衡時，煮5%的瓊脂糖10ml。
雙向電泳第二向---SDS-PAGE
[編輯]配膠(兩根膠條所用劑量)
[編輯]分離膠：（T=8% 80 ml）：溶液於真空機中抽氣後再加APS和TEMED
30 % 丙烯醯胺儲液 21.28ml
分離膠buffer 20ml 10%APS 220μl TEMED 44μl
雙蒸水 38.72ml
濃縮膠：（T=4.8% 10ml）
30 % 丙烯醯胺儲液 1.6ml
濃縮膠buffer 2.5ml 10%APS 30μl TEMED 5μl
雙蒸水 5.9ml
灌膠
[編輯]將玻璃板洗淨後,室溫晾乾,然後,將電泳槽平衡好,玻璃板夾好,再在玻璃板底部塗上凡士林以防漏膠,倒入正丁醇壓膠,凝膠後(這時會出現三條線),用注射器吸去正丁醇,超純水洗兩次,再用濾紙除水後,倒入濃縮膠,正丁醇壓膠,凝膠後,用注射器吸去正丁醇,超純水洗兩次,再加入超純水,用保險膜封好。
轉移
[編輯]剪兩個小的濾紙片，吸取Marker後，放入SDS—PAGE膠面的一端。然後，將平衡好的IPG膠條貼靠在玻璃板上,加少量的5%的瓊脂糖溶液在膠面上(瓊脂糖凝膠在轉移前十幾分鐘的時候配好,水浴加熱溶解,並保持燒杯中水處於沸騰狀態,至用之前再拿出來),再將IPG膠條緩緩加入SDS—PAGE膠面,其中不斷補加5%的瓊脂糖溶液,注意不能產生氣泡。
跑膠
[編輯]濃縮膠 13mA 分離膠 20mA 共約5.5個小時
銀染(兩根膠條所用劑量)（銀染特別注意用超純水）
[編輯]- 固定 30min 無水乙醇 200ml+乙酸50ml，用超純水定容至500ml
- 敏化 30min 無水乙醇 150ml
- Na2S2O3S226;5H2O 1.5688g
- 無水乙酸鈉 34g
- 先用水溶解Na2S2O3S226;5H2O和乙酸鈉,再加乙醇,最後定容至500ml
- 洗滌 5min × 3次
- 銀染 20min AgNO3 1.25g 用超純水定容至500ml
- 洗滌 1min × 2次
- 顯影 無水Na2CO3 12.5g 用超純水定容至500ml
- 甲醛(37%)0.1ml,臨時加
- 終止 10min EDTA—Na2S226;2H2O 7.3g 用超純水定容至500ml
- 洗滌 5min × 3次
註：整個雙向電泳實驗中全部使用超純水，儘量減少離子的影響。
實驗相關試劑配製
[編輯]Bradford 工作液
[編輯]95%乙醇 25ml 先用乙醇溶解考馬斯亮蘭G250，溶解完後再加磷
85%磷酸 52ml 酸，最後超純水定容至500ml。過濾後置於棕色瓶
考馬斯亮蘭G250 0.035g 外加油皮紙保存（Bradford不穩定，一周內有效）
裂解液
[編輯]尿素 8M
硫脲 2M
CHAPS 4%
DTT 60 mM
Tris—base 40 mM（如果有條件可以添加PMSF 0.5mM和5%的Pharmalate）
水化液儲液
[編輯]尿素 8M
硫脲 2M
CHAPS 4%
Tris—base 40 mM
分離膠buffer (pH8.8) 250ml
[編輯]SDS 0.4% 1g
Tris—HCl 1.5M 45.4275g
濃縮膠buffer (pH6.8) 100ml
[編輯]SDS 0.4% 0.4g
Tris—HCl 0.5M 6.07g
凝膠儲存液（30%的丙烯醯胺）250ml
[編輯]Acr 29.2% 73g
Bis 0.8% 2g
電極緩衝液（跑一次要配製2500ml）
[編輯]甘氨酸 43.2g 36g
Tris 9g 或 7.5g
SDS 3g 2.5g
超純水定容至3000ml 超純水定容至2500ml
0.5M Tris —HCl pH 6.8儲液
[編輯]6.1g Tris先用30ml超純水溶解，再用46ml，3M HCl調pH6.8,再加水定容至100ml
平衡液儲液
[編輯]脲（即尿素）36g
甘油 30% 30ml
SDS 1% 1g
0.5M Tris—HCl pH6.8 10ml 超純水定容至100ml
平衡液A（一根膠條）
[編輯]DTT 20mg
平衡液儲液 10ml
平衡液B（一根膠條）
[編輯]碘乙醯氨 300mg
平衡液儲液 10ml
0.05%溴酚蘭 15μl (平衡液A、B均需臨時配製)
0.5%瓊脂糖10ml
[編輯]瓊脂糖 0.05g
電極緩衝液 10ml
溴酚蘭 25μl
補：4、5、6的溶液需過濾後儲存於4C備用。
藥品
[編輯]CHAPS 兼性離子去垢劑 去垢劑可破壞蛋白質分子之間的疏水相互作用，SDS 離子型去垢劑 提高蛋白質的溶解性，防止在等電聚焦時析出尿素
離液劑 可改變或破壞氫鍵等次級鍵的結構，使蛋白質硫脲
離液劑 變性並使蛋白失活。尿素和硫脲聯合使用，可以大大增加蛋白質的溶解性
DTT 還原劑 斷裂蛋白質分子中Cys殘基之間形成的二硫鍵，增加蛋白質的溶解性。但過分提高DTT的濃度，由於它pKa在8左右，因而會影響pH梯度。DTT在鹼性pH下會去質子化，等電聚焦時會損耗，導致二硫鍵復原，蛋白質沉澱
BSA Bradford中製作標準曲線用
無水乙醇 和磷酸一起，提供Bradford中的環境
磷酸 提供Bradford中的酸性環境
Tris 構成緩衝液的成分，可用於抗衡pH的變化
IPG buffer
覆蓋液 即礦物油，防止水分蒸發，樣品乾燥。
丙烯醯胺（Acr） 以丙烯醯胺為單體，甲叉二丙烯醯胺為交聯劑，
甲叉二丙烯醯胺 （Bis）在催化劑（Aps）和引發劑（TEMED）作用下，聚合交聯成三維網狀結構
瓊脂糖
溴酚蘭 指示劑作用
碘乙醯氨（IAA）平衡液B中使用，中和A液中的DTT
正丁醇 比聚丙烯醯胺密度小，用於凝膠製作過程中的壓膠
甘油 無機鹽的良好溶劑，熱穩定性好
Marker
考馬斯亮蘭G250（Bradford法用）考馬斯亮蘭G250有紅、藍兩種不同顏色的形式在一定濃度的乙醇及酸性條件下，可配成淡紅色的溶液，當與蛋白結合後，產生藍色化合物，反應迅速而穩定，反應化合物在465~595nm處有最大的光吸收值，化合物顏色 深淺與蛋白濃度的高低成正比關係，因此可檢測595nm的光吸收值的大小計算蛋白的含量
甘氨酸 與Tris構成緩衝系統
AgNO3
EDTA 金屬螯合劑，可以結合銀離子，終止銀染過程。