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生物化學與分子生物學/逆轉錄

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DNA的生物合成 - DNA複製的基本規律 - DNA複製的酶學和拓撲學 - 原核生物DNA複製過程 - 真核生物DNA複製過程 - 逆轉錄
雙鏈DNA是大多數生物的遺傳物質 。然而,某些病毒的遺傳物質是RNA。原核生物的質粒,真核生物的線粒體DNA,都是染色體外存在的DNA。這些非染色體基因組,採用特殊的方式進行複製。

逆轉錄病毒的基因組RNA以逆轉錄機制複製[編輯]

RNA病毒的基因組是 RNA 而不是 DNA,其複製方式是逆轉錄(reverse transcription), 因此也稱為逆轉錄病毒(retrovirus)。但是並非所有的 RNA 病毒都是逆轉錄病毒。逆轉錄的信息流動方向(RNA→DNA) 與轉錄過程(DNA→RNA) 相反,是一種特殊的複製方式。1970 年,H.Temin 和 D.Baltimore分別從 RNA 病毒中發現能催化以 RNA 為模板合成雙鏈 DNA 的酶,稱為逆轉錄酶(reverse transcriptase),全稱是依賴RNA的DNA聚合酶(RNA-dependent DNA polymerase)。
從單鏈RNA到雙鏈DNA的生成可分為三步:首先是逆轉錄酶以病毒基因組RNA為模板,催化dNTP聚合生成DNA互補鏈,產物是RNA/DNA雜化雙鏈。然後,雜化雙鏈中的RNA被逆轉錄酶中有RNase活性的組分水解,被感染細胞內的RNase H(H=Hybrid)也可水解RNA鏈。RNA分解後剩下的單鏈DNA再用作模板,由逆轉錄酶催化合成第二條DNA互補鏈。逆轉錄酶有三種活性:RNA指導的DNA聚合酶活性,DNA指導的DNA聚合酶活性和RNase H活性,作用需Zn2+為輔因子。合成反應也按照5'→3'延長的規律。有研究發現,病毒自身的tRNA可用作複製引物。
按上述方式,RNA 病毒在細胞內複製成雙鏈 DNA 的前病毒(provirus)。前病毒保留了 RNA 病毒 全部遺傳信息,並可在細胞內獨立繁殖。在某些情況下,前病毒基因組通過基因重組(gene recombination), 插入到細胞基因組內,並隨宿主基因一起複製和表達。這種重組方式稱為整合(integration)。前病毒獨立繁殖或整合,可成為致病的原因。

逆轉錄的發現發展了中心法則[編輯]

逆轉錄酶或逆轉錄現象的發現是分子生物學研究中的重大事件。中心法則認為,DNA 的功能兼有遺傳信息的傳代和表達,因此 DNA 處於生命活動的中心位置。逆轉錄現象說明,至少在某些生物,RNA 同樣兼有遺傳信息傳代功能。這是對傳統的中心法則的挑戰。
對逆轉錄病毒的研究,拓寬了20世紀初已注意到的病毒致癌理論,至20世紀70年代初,從逆轉錄病毒中發現了癌基因。至今,癌基因研究仍是病毒學、腫瘤學和分子生物學領域的重大課題。艾滋病病原人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)也是RNA病毒,有逆轉錄活性。
分子生物學研究還應用逆轉錄酶作為獲取基因工程目的基因的重要方法之一,此法稱為cDNA法。在人類這樣龐大的基因組DNA(3.2xl09bp)中,要選取其中一個目的基因,有相當大難度。對RNA進行提取、純化,相對較為可行。取得RNA後,可以通過逆轉錄方式在試管內操作。用逆轉錄酶催化dNTP在RNA模板指引下的聚合,生成RNA/DNA雜化雙鏈。用酶或鹼把雜化雙鏈上的RNA除去,剩下的DNA單鏈再作為第二鏈合成的模板。在試管內以DNA pol Ⅰ的大片段,即Klenow片段催化dNTP聚合。第二次合成的雙鏈DNA, 稱為cDNA。c是互補(complementary)的意思。cDNA就是編碼蛋白質的基因,通過轉錄又得到原來的模板RNA,現在已利用該方法建立了多種不同種屬和細胞來源的含所有表達基因的cDNA文庫,方便人們從中獲取目的基因。