生物化學與分子生物學/DNA實驗技術/基因定點突變
定點突變的目的
[編輯]把目的基因上面的一個鹼基換成另外一個鹼基。
定點突變的原理
[編輯]通過設計引物，並利用PCR將模板擴增出來，然後去掉模板，剩下來的就是我們的PCR產物，在PCR產物上就已經把這個點變過來了，然後再轉化，篩選陽性克隆，再測序確定就行了。
引物設計原則
[編輯]引物設計的一般原則不再重複。
突變引物設計的特殊原則：
- 通常引物長度為25~45 bp，我們建議引物長度為30~35 bp。一般都是以要突變的鹼基為中心，加上兩邊的一段序列，兩邊長度至少為11-12 bp。若兩邊引物太短了，很可能會造成突變實驗失敗，因為引物至少要11-12個bp才能與模板搭上，而這種突變PCR要求兩邊都能與引物搭上，所以兩邊最好各設至少12個bp，並且合成多一條反向互補的引物。
- 如果設定的引物長度為30 bp，接下來需要計算引物的Tm值，看是否達到78℃（GC含量應大於40%）。
- 如果Tm值低於78℃，則適當改變引物的長度以使其Tm值達到78℃（GC含量應大於40%）。
- 設計上下游引物時確保突變點在引物的中央位置。
- 最好使用經過純化的引物。
Tm值計算公式：Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5
註：L：引物鹼基數；% of GC：引物GC含量。
引物設計實例
[編輯]以GCG→ACG為例：
5』-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3』
- 首先設計30 bp長的上下游引物，並將A (T)設計在引物的中央位置。
Primer #1: 5』-CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3』
Primer #2: 5』-GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG-3』
- 引物GC含量為40%，L為30，將這兩個數值帶入Tm值計算公式，得到其Tm=75.5（Tm=0.41×40-675/30+81.5）。通過計算可以看出其Tm低於78℃，這樣的引物是不合適的，所以必須調整引物長度。
- 重新調整引物長度。
Primer #1: 5』-CCTCCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3』
Primer #2: 5』-CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3』
在引物兩端加5mer（斜體下劃線處），這樣引物的GC含量為45.7%，L值為35，將這兩個數值帶入Tm值計算公式，得到其Tm為80.952（Tm=0.41×47.5-675/35+81.5），這樣的引物就可以用於突變實驗了。
突變所用聚合酶及Buffer
[編輯]引物和質粒都準備好後，當然就是做PCR嘍，不過對於PCR的酶和buffer，不能用平時的，我們做PCR把整個質粒擴出來，延伸長度達到幾個K，所以要用那些GC buffer或擴增長片段的buffer，另外，要用保真性能較好的PFU酶來擴增，防止引進新的突變。
除了使用基因定點突變試劑盒，如Stratagene和塞百盛的試劑盒，但價格昂貴。可以使用高保真的聚合酶，如博大泰克的金牌快速taq酶、Takara的PrimeSTARTM HS DNA polymerase。
如何去掉PCR產物
[編輯]最簡單的方法就是用DpnI酶，DpnI能夠識別甲基化位點並將其酶切，我們用的模板一般都是雙鏈超螺旋質粒，從大腸桿菌里提出來的質粒一般都被甲基化保護起來（除非你用的是甲基化缺陷型的菌株），而PCR產物都是沒有甲基化的，所以DpnI酶能夠特異性地切割模板（質粒）而不會影響PCR產物，從而去掉模板留下PCR產物，所以提質粒時那些菌株一定不能是甲基化缺陷株。
DpnI處理的時間最好長一點，最少一個小時吧，最好能有兩三個小時，因為如果模板處理得不乾淨，哪怕只有那麼一點點，模板直接在平板上長出來，就會導致實驗失敗。
如何拿到質粒
[編輯]直接把通過DpnI處理的PCR產物拿去做轉化就行了，然後再篩選出陽性克隆，並提出質粒，拿去測序，驗證突變結果。
原理圖示
[編輯]定點突變操作步驟
[編輯]誘導突變基因（PCR反應）
[編輯]以待突變的質粒為模板，用設計的引物及Muta-direct™酶進行PCR擴增反應，誘導目的基因突變。
設計點突變引物。 [注]參考引物設計指導
準備模板質粒DNA
[編輯][注]用dam+型菌株（例如DH5α菌株）作為宿主菌。在end+型菌株中常有克隆數低的現象，但是對突變效率沒有影響。提取質粒DNA時我們建議您使用本公司的質粒提純試劑盒。
對照反應體系（50μl反應體系）
[編輯]| 10×Reaction Buffer | 5μl |
| pUC18 control plasmid（10ng/μl，total 20ng） | 2μl |
| Control primer mix（20pmol/μl） | 2μl |
| dNTP mixture（each 2.5mM） | 2μl |
| dH2O | 38μl |
| Muta-direct™ Enzyme | 1μl |
樣品反應體系（50μl反應體系）
[編輯]| 10×Reaction Buffer | 5μl |
| Sample plasmid（10ng/μl，total 20ng） | 2μl |
| Sample primer (F)（10pmol/μl） | 1μl |
| Sample primer (R)（10pmol/μl） | 1μl |
| dNTP mixture（each 2.5mM） | 2μl |
| dH2O | 38μl |
| Muta-direct™ Enzyme | 1μl |
PCR反應條件
[編輯]| Cycles | Temperature | Reaction Time |
|---|---|---|
| 1cycle | 95℃ | 30sec |
| 15cycle | 95℃ | 30sec |
| 55℃ | 1min | |
| 72℃ | 1min per plasmid Kb |
PCR擴增
[編輯]PCR擴增反應完成後冰育5分鐘，然後置於室溫（避免反覆凍融）。
[注] 按下列提供的PCR條件進行擴增，控制PCR循環數。注意當突變點位點超過4個時會發生突變率降低的現象。
| Mutation | Cycles |
|---|---|
| 1~2 Nucleotide | 15 cycles |
| 3 Nucleotides | 18 cycles |
突變質粒選擇
[編輯]PCR反應結束後使用Mutazyme™酶消化甲基化質粒從而選擇突變質粒DNA。
- 準備PCR反應產物
- 加入1μl（10U/μl）Mutazyme™酶37℃溫育1小時。
[注]當質粒DNA用量過多時Mutazyme™酶可能發生與樣品反應不完全的現象。因此我們建議為了保證突變率請嚴格遵照實驗步驟進行操作。如果突變率低，可以適當延長反應時間或增加Mutazyme™酶用量。
轉化
[編輯]反應完畢後在質粒DNA上會產生缺口，當把這個質粒DNA轉入E.coli中時請選擇dam+型菌株，例如DH5α。
- 將10μl樣品加到50μl感受態細胞里，然後放置在冰上30分鐘。
- 接下來可以參照一般的轉化步驟進行。
序列分析
[編輯]通常當LB平板上出白色菌落則表明發生了突變。
為了證實這一結果，建議對白色單菌落進行測序分析。