生物化學與分子生物學/DNA實驗技術/基因定點突變

維基教科書,自由的教學讀本
跳至導覽 跳至搜尋

定點突變的目的[編輯]

把目的基因上面的一個鹼基換成另外一個鹼基。

定點突變的原理[編輯]

通過設計引物,並利用PCR將模板擴增出來,然後去掉模板,剩下來的就是我們的PCR產物,在PCR產物上就已經把這個點變過來了,然後再轉化,篩選陽性克隆,再測序確定就行了。

引物設計原則[編輯]

引物設計的一般原則不再重複。

突變引物設計的特殊原則:

  1. 通常引物長度為25~45 bp,我們建議引物長度為30~35 bp。一般都是以要突變的鹼基為中心,加上兩邊的一段序列,兩邊長度至少為11-12 bp。若兩邊引物太短了,很可能會造成突變實驗失敗,因為引物至少要11-12個bp才能與模板搭上,而這種突變PCR要求兩邊都能與引物搭上,所以兩邊最好各設至少12個bp,並且合成多一條反向互補的引物。
  2. 如果設定的引物長度為30 bp,接下來需要計算引物的Tm值,看是否達到78℃(GC含量應大於40%)。
  3. 如果Tm值低於78℃,則適當改變引物的長度以使其Tm值達到78℃(GC含量應大於40%)。
  4. 設計上下游引物時確保突變點在引物的中央位置。
  5. 最好使用經過純化的引物。

Tm值計算公式:Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5

註:L:引物鹼基數;% of GC:引物GC含量。

引物設計實例[編輯]

以GCG→ACG為例:

5』-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3』

  • 首先設計30 bp長的上下游引物,並將A (T)設計在引物的中央位置。

Primer #1: 5』-CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3』

Primer #2: 5』-GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG-3』

  • 引物GC含量為40%,L為30,將這兩個數值帶入Tm值計算公式,得到其Tm=75.5(Tm=0.41×40-675/30+81.5)。通過計算可以看出其Tm低於78℃,這樣的引物是不合適的,所以必須調整引物長度。
  • 重新調整引物長度。

Primer #1: 5』-CCTCCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3』

Primer #2: 5』-CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3』

在引物兩端加5mer(斜體下劃線處),這樣引物的GC含量為45.7%,L值為35,將這兩個數值帶入Tm值計算公式,得到其Tm為80.952(Tm=0.41×47.5-675/35+81.5),這樣的引物就可以用於突變實驗了。

突變所用聚合酶及Buffer[編輯]

引物和質體都準備好後,當然就是做PCR嘍,不過對於PCR的酶和buffer,不能用平時的,我們做PCR把整個質體擴出來,延伸長度達到幾個K,所以要用那些GC buffer或擴增長片段的buffer,另外,要用保真性能較好的PFU酶來擴增,防止引進新的突變。

除了使用基因定點突變試劑盒,如Stratagene和塞百盛的試劑盒,但價格昂貴。可以使用高保真的聚合酶,如博大泰克的金牌快速taq酶、Takara的PrimeSTARTM HS DNA polymerase。

如何去掉PCR產物[編輯]

最簡單的方法就是用DpnI酶,DpnI能夠識別甲基化位點並將其酶切,我們用的模板一般都是雙鏈超螺旋質體,從大腸桿菌里提出來的質體一般都被甲基化保護起來(除非你用的是甲基化缺陷型的菌株),而PCR產物都是沒有甲基化的,所以DpnI酶能夠特異性地切割模板(質體)而不會影響PCR產物,從而去掉模板留下PCR產物,所以提質體時那些菌株一定不能是甲基化缺陷株。

DpnI處理的時間最好長一點,最少一個小時吧,最好能有兩三個小時,因為如果模板處理得不乾淨,哪怕只有那麼一點點,模板直接在平板上長出來,就會導致實驗失敗。

如何拿到質體[編輯]

直接把通過DpnI處理的PCR產物拿去做轉化就行了,然後再篩選出陽性克隆,並提出質體,拿去測序,驗證突變結果。

原理圖示[編輯]

定點突變操作步驟[編輯]

誘導突變基因(PCR反應)[編輯]

以待突變的質體為模板,用設計的引物及Muta-direct™酶進行PCR擴增反應,誘導目的基因突變。

設計點突變引物。 [注]參考引物設計指導

準備模板質體DNA[編輯]

[注]用dam+型菌株(例如DH5α菌株)作為宿主菌。在end+型菌株中常有克隆數低的現象,但是對突變效率沒有影響。提取質體DNA時我們建議您使用本公司的質體提純試劑盒。

對照反應體系(50μl反應體系)[編輯]

50μl反應體系
10×Reaction Buffer 5μl
pUC18 control plasmid(10ng/μl,total 20ng) 2μl
Control primer mix(20pmol/μl) 2μl
dNTP mixture(each 2.5mM) 2μl
dH2O 38μl
Muta-direct™ Enzyme 1μl

樣品反應體系(50μl反應體系)[編輯]

50μl反應體系
10×Reaction Buffer 5μl
Sample plasmid(10ng/μl,total 20ng) 2μl
Sample primer (F)(10pmol/μl) 1μl
Sample primer (R)(10pmol/μl) 1μl
dNTP mixture(each 2.5mM) 2μl
dH2O 38μl
Muta-direct™ Enzyme 1μl

PCR反應條件[編輯]

按如下參數設置PCR擴增條件。
Cycles Temperature Reaction Time
1cycle 95℃ 30sec
15cycle 95℃ 30sec
55℃ 1min
72℃ 1min per plasmid Kb

PCR擴增[編輯]

PCR擴增反應完成後冰育5分鐘,然後置於室溫(避免反覆凍融)。

[注] 按下列提供的PCR條件進行擴增,控制PCR循環數。注意當突變點位點超過4個時會發生突變率降低的現象。

Mutation Cycles
1~2 Nucleotide 15 cycles
3 Nucleotides 18 cycles

突變質體選擇[編輯]

PCR反應結束後使用Mutazyme™酶消化甲基化質體從而選擇突變質體DNA。

  1. 準備PCR反應產物
  2. 加入1μl(10U/μl)Mutazyme™酶37℃溫育1小時。

[注]當質體DNA用量過多時Mutazyme™酶可能發生與樣品反應不完全的現象。因此我們建議為了保證突變率請嚴格遵照實驗步驟進行操作。如果突變率低,可以適當延長反應時間或增加Mutazyme™酶用量。

轉化[編輯]

反應完畢後在質體DNA上會產生缺口,當把這個質體DNA轉入E.coli中時請選擇dam+型菌株,例如DH5α。

  1. 將10μl樣品加到50μl感受態細胞里,然後放置在冰上30分鐘。
  2. 接下來可以參照一般的轉化步驟進行。

序列分析[編輯]

通常當LB平板上出白色菌落則表明發生了突變。

為了證實這一結果,建議對白色單菌落進行測序分析。