生物化學與分子生物學/PCR實驗技術/PCR產物的TA克隆

實驗原理

DNA片段回收方法：DNA片段在適當濃度的瓊脂糖凝膠中，通上一定電壓進行電泳，不同大小的DNA分子由於遷移率的不同而分離開。切下帶有所需DNA片段的凝膠，用凍融法、玻璃奶回收法或商品化膠回收試劑盒將目的片段回收純化。
利用Taq酶能夠在PCR產物的3』末端加上一個非模板依賴的A，而T載體是一種帶有3』T突出端的載體，在連接酶作用下，可以把PCR產物插入到質粒載體的多克隆位點，可用於PCR產物的克隆和測序。

商品化的T載體有很多。本實驗採用TaKaRa公司的pMDTM18-T Simple Vector。這個載體以pUC19載體為基礎，消除了pUC18載體上的多克隆酶切位點，經EcoRⅤ酶切後在兩側的3＇端添上「T」製備而成（見附錄1）。由於本載體上消除了多克隆酶切位點，克隆後的PCR產物將無法使用載體上的限制酶切下，需要在PCR擴增引物上導入合適的酶切位點。

試劑與器材

試劑

pMDTM18-T Simple Vector Kit（Takara公司）。
TAE電泳緩衝液
瓊脂糖（Agarose）
6×電泳加樣緩衝液：0.25％溴粉藍，40％(w/v) 蔗糖水溶液，貯存於 4℃。
溴化乙錠(EB)溶液母液：配製成10mg/mL，用鋁箔或黑紙包裹容器，儲於室溫即可。
70%乙醇
膠回收試劑盒（Omega公司）

器材

水平式電泳裝置,電泳儀,台式高速離心機, 恆溫水浴鍋, 微量移液槍, 微波爐或電爐,紫外透射儀, 凝膠成像系統或其它照相設備。

操作方法

膠回收試劑盒回收PCR產物（以Omega公司 Gel Extraction Kit為例）

當目的片段DNA完全分離時，轉移凝膠至紫外燈上儘可能快地切下目的片段。
凝膠塊轉移至1.5ml離心管(離心管已經稱重了)中，稱重得出凝膠塊的重量。近似地確定其體積（假設其密度為1g/ml）。加入等體積的Binding Buffer（XP2），於55-65℃水浴中溫浴7min或至凝膠完全融化，每2-3 min振盪混合物。（在凝膠完全溶解之後，注意凝膠-Binding buffer混和物的pH值。如果其pH值大於8的話，DNA的產量將大大減少。如果是橙色或紅色，則要加入5μl 濃度為5 M，pH為5.2的醋酸鈉，以調低其pH值。該混合物的顏色將恢復為正常的淺黃色。）
取一個乾淨的HiBind DNA Mini柱子裝在一個干凈的2ml收集管內（已備好）。
將第三步獲得的DNA/熔膠液全部轉移至柱子中。室溫下10,000 x g離心1分鐘。棄收集管中的濾液，將柱子套回2ml收集管內收集管。
如果DNA/凝膠熔液的體積超過700ul，一次只能轉移700ul至柱子中，餘下的可繼續重複第5步至所有的溶液都經過柱子。每一個Hibind DNA回收純化柱都有一個極限為25μg DNA的吸附能力。如果預期產量較大，則把樣品分別加到合適數目的柱子中。
棄收集管中的濾液，將柱子套回2ml收集管內收集管。轉移300μl Binding Buffer（XP2）至柱子中，室溫下， 10,000 x g下離心1min。
棄收集管中的濾液，將柱子套回2ml收集管內收集管。轉移700μl SPW Wash buffer（已用無水乙醇稀釋的）至柱子中。室溫下10,000xg離心1min。（濃縮的SPW Wash Buffer在使用之前必須按標籤的提示用乙醇稀釋。如果DNA洗滌緩衝液在使用之前是置於冰箱中的，須將其拿出置於室溫下）。
重複用700μl SPW Wash buffer洗滌柱子。室溫下10,000xg離心1min。
棄收集管中的濾液，將柱子套回2ml收集管內收集管。室溫下,13,000 x g離心2 min以甩干柱子基質殘餘的液體。
把柱子裝在一個干凈的1.5ml離心管上，加入15~30μl（具體取決於預期的終產物濃度）的Elution Buffer(或TE緩衝液)到柱基質上，室溫放置1min, 13,000xg離心1min以洗脫DNA。第一次洗脫可以洗出70-80%的結合DNA。如果再洗脫一次的話，可以把殘餘的DNA洗脫出來，不過那樣的濃度就會較低。

連接反應（以Takara公司pMDTM18-T Simple Vector Kit為例）

在微量離心管中配製下列DNA溶液，全量為5 μl。


pMDTM18-T Simple Vector	1 μl
Insert DNA	0.1 pmol～0.3 pmol
dH₂O	up to 5 μl

加入5 μl（等量）的 Solution I。
16℃反應30分鐘。（2 kbp以上長片段PCR產物進行DNA克隆時，連接反應時間請延長至數小時）。
全量（10 μl）加入至100 μl 感受態細胞中，冰中放置30分鐘。
42℃加熱45秒鐘後，再在冰中放置1分鐘。
加入890 μl LB培養基，37℃振盪培養60分鐘。
在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板培養基上培養，形成單菌落。計數白色、藍色菌落。
挑選白色菌落，鑑定載體中插入片段的長度大小。

注意事項與提示

使用新鮮的電泳緩衝液TAE Buffer。不要重複使用，其PH的升高會減少產量。
不論採取何種方法回收DNA，在回收過程中，要儘量減少洗脫體積，以便提高收得率和濃度，以方便後續操作。
從膠上回收DNA時，應儘量縮短光照時間並採用長波長紫外燈(300-360nm)，以減少紫外光對DNA的切割。DNA曝露在紫外燈下不能超過30秒。
連接反應時間是與溫度密切相關，因為反應速度隨溫度的提高而加快。通常可採用16℃連接4小時為宜，如是平端連接需要適當延長反應時間以提高連接效率；在選擇反應的溫度與時間關係時，也要考慮在反應系統中其他因素的影響。
連接反應的整個過程應注意槍頭的潔淨以避免造成對酶的污染，為防止酶活性降低，取酶時應在冰上操作且動作迅速。
連接反應應在25℃以下進行，溫度升高較難形成環狀DNA，影響連接效率。長片段PCR產物（2kb以上）進行連接時，連接反應時間應延長至數小時。
進行克隆時，Vector DNA和Insert DNA的摩爾數比一般為1:2~10。根據實驗情況選擇合適的摩爾數比。
用高效的感受態細胞（轉化效率≥1×108 cfu/μg pUC19），這樣才可能得到比較理想的陽性克隆。
- 轉化效率的計算：取0.1 ng的pUC19 Plasmid DNA加入至100μl的感受態細胞中後，再加入900 μl 的LB培養基(0.1 ng DNA/ml)，將上述培養液稀釋10倍後(0.01 ng DNA/ml) 。
- 取100 μl塗布平板(0.001 ng DNA/100 μl)，記錄菌落數。以得到200個克隆體為例計算轉化效率，此時的轉化效率=200 cfu/0.001 ng=2x10⁵ cfu/ng=2x10⁸ cfu/μg pUC19 DNA。
試劑盒配有Control DNA。通過對照實驗判斷試劑盒的保存效果。

實驗報告要求與思考題

1．PCR產物的T-vector克隆方法，應注意哪些操作環節？

2．和其他組結果比較，對本組實驗結果進行分析。

3．對於用高保真Taq DNA聚合酶擴增的PCR產物，如何進行克隆？