生物化學與分子生物學/PCR實驗技術/PCR產物的TA克隆

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實驗原理[編輯]

  1. DNA片段回收方法:DNA片段在適當濃度的瓊脂糖凝膠中,通上一定電壓進行電泳,不同大小的DNA分子由於遷移率的不同而分離開。切下帶有所需DNA片段的凝膠,用凍融法、玻璃奶回收法或商品化膠回收試劑盒將目的片段回收純化。
  2. 利用Taq酶能夠在PCR產物的3』末端加上一個非模板依賴的A,而T載體是一種帶有3』T突出端的載體,在連接酶作用下,可以把PCR產物插入到質體載體的多克隆位點,可用於PCR產物的克隆和測序。

商品化的T載體有很多。本實驗採用TaKaRa公司的pMDTM18-T Simple Vector。這個載體以pUC19載體為基礎,消除了pUC18載體上的多克隆酶切位點,經EcoRⅤ酶切後在兩側的3'端添上「T」製備而成(見附錄1)。由於本載體上消除了多克隆酶切位點,克隆後的PCR產物將無法使用載體上的限制酶切下,需要在PCR擴增引物上導入合適的酶切位點。

試劑與器材[編輯]

試劑[編輯]

  1. pMDTM18-T Simple Vector Kit(Takara公司)。
  2. TAE電泳緩衝液
  3. 瓊脂糖(Agarose)
  4. 6×電泳加樣緩衝液:0.25% 溴粉藍,40%(w/v) 蔗糖水溶液,貯存於 4℃。
  5. 溴化乙錠(EB)溶液母液:配製成10mg/mL,用鋁箔或黑紙包裹容器,儲於室溫即可。
  6. 70%乙醇
  7. 膠回收試劑盒(Omega公司)

器材[編輯]

水平式電泳裝置,電泳儀,台式高速離心機, 恆溫水浴鍋, 微量移液槍, 微波爐或電爐,紫外透射儀, 凝膠成像系統或其它照相設備。

操作方法[編輯]

膠回收試劑盒回收PCR產物(以Omega公司 Gel Extraction Kit為例)[編輯]

  1. 當目的片段DNA完全分離時,轉移凝膠至紫外燈上儘可能快地切下目的片段。
  2. 凝膠塊轉移至1.5ml離心管(離心管已經稱重了)中,稱重得出凝膠塊的重量。近似地確定其體積(假設其密度為1g/ml)。加入等體積的Binding Buffer(XP2),於55-65℃水浴中溫浴7min或至凝膠完全融化,每2-3 min振盪混合物。(在凝膠完全溶解之後,注意凝膠-Binding buffer混和物的pH值。如果其pH值大於8的話,DNA的產量將大大減少。如果是橙色或紅色,則要加入5μl 濃度為5 M,pH為5.2的醋酸鈉,以調低其pH值。該混合物的顏色將恢復為正常的淺黃色。)
  3. 取一個乾淨的HiBind DNA Mini柱子裝在一個干凈的2ml收集管內(已備好)。
  4. 將第三步獲得的DNA/熔膠液全部轉移至柱子中。室溫下10,000 x g離心1分鐘。棄收集管中的濾液,將柱子套回2ml收集管內收集管。
  5. 如果DNA/凝膠熔液的體積超過700ul,一次只能轉移700ul至柱子中,餘下的可繼續重複第5步至所有的溶液都經過柱子。每一個Hibind DNA回收純化柱都有一個極限為25μg DNA的吸附能力。如果預期產量較大,則把樣品分別加到合適數目的柱子中。
  6. 棄收集管中的濾液,將柱子套回2ml收集管內收集管。轉移300μl Binding Buffer(XP2)至柱子中,室溫下, 10,000 x g下離心1min。
  7. 棄收集管中的濾液,將柱子套回2ml收集管內收集管。轉移700μl SPW Wash buffer(已用無水乙醇稀釋的)至柱子中。室溫下10,000xg離心1min。(濃縮的SPW Wash Buffer在使用之前必須按標籤的提示用乙醇稀釋。如果DNA洗滌緩衝液在使用之前是置於冰箱中的,須將其拿出置於室溫下)。
  8. 重複用700μl SPW Wash buffer洗滌柱子。室溫下10,000xg離心1min。
  9. 棄收集管中的濾液,將柱子套回2ml收集管內收集管。室溫下,13,000 x g離心2 min以甩干柱子基質殘餘的液體。
  10. 把柱子裝在一個干凈的1.5ml離心管上,加入15~30μl(具體取決於預期的終產物濃度)的Elution Buffer(或TE緩衝液)到柱基質上,室溫放置1min, 13,000xg離心1min以洗脫DNA。第一次洗脫可以洗出70-80%的結合DNA。 如果再洗脫一次的話,可以把殘餘的DNA洗脫出來,不過那樣的濃度就會較低。

連接反應(以Takara公司pMDTM18-T Simple Vector Kit為例)[編輯]

  • 在微量離心管中配製下列DNA溶液,全量為5 μl。
pMDTM18-T Simple Vector 1 μl
Insert DNA 0.1 pmol~0.3 pmol
dH2O up to 5 μl
  • 加入5 μl(等量)的 Solution I。  
  • 16℃反應30分鐘。(2 kbp以上長片段PCR產物進行DNA克隆時,連接反應時間請延長至數小時)。
  • 全量(10 μl)加入至100 μl 感受態細胞中,冰中放置30分鐘。
  • 42℃加熱45秒鐘後,再在冰中放置1分鐘。
  • 加入890 μl LB培養基,37℃振盪培養60分鐘。
  • 在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板培養基上培養,形成單菌落。計數白色、藍色菌落。
  • 挑選白色菌落,鑑定載體中插入片段的長度大小。

注意事項與提示[編輯]

  1. 使用新鮮的電泳緩衝液TAE Buffer。不要重複使用,其PH的升高會減少產量。
  2. 不論採取何種方法回收DNA,在回收過程中,要儘量減少洗脫體積,以便提高收得率和濃度,以方便後續操作。
  3. 從膠上回收DNA時,應儘量縮短光照時間並採用長波長紫外燈(300-360nm),以減少紫外光對DNA的切割。DNA曝露在紫外燈下不能超過30秒。
  4. 連接反應時間是與溫度密切相關,因為反應速度隨溫度的提高而加快。通常可採用16℃連接4小時為宜,如是平端連接需要適當延長反應時間以提高連接效率;在選擇反應的溫度與時間關係時,也要考慮在反應系統中其他因素的影響。
  5. 連接反應的整個過程應注意槍頭的潔淨以避免造成對酶的污染,為防止酶活性降低,取酶時應在冰上操作且動作迅速。
  6. 連接反應應在25℃以下進行,溫度升高較難形成環狀DNA,影響連接效率。長片段PCR產物(2kb以上)進行連接時,連接反應時間應延長至數小時。
  7. 進行克隆時,Vector DNA和Insert DNA的摩爾數比一般為1:2~10。根據實驗情況選擇合適的摩爾數比。
  8. 用高效的感受態細胞(轉化效率≥1×108 cfu/μg pUC19),這樣才可能得到比較理想的陽性克隆。
    • 轉化效率的計算:取0.1 ng的pUC19 Plasmid DNA加入至100μl的感受態細胞中後,再加入900 μl 的LB培養基(0.1 ng DNA/ml),將上述培養液稀釋10倍後(0.01 ng DNA/ml) 。
    • 取100 μl塗布平板(0.001 ng DNA/100 μl),記錄菌落數。以得到200個克隆體為例計算轉化效率,此時的轉化效率=200 cfu/0.001 ng=2x105 cfu/ng=2x108 cfu/μg pUC19 DNA。
  9. 試劑盒配有Control DNA。通過對照實驗判斷試劑盒的保存效果。

實驗報告要求與思考題[編輯]

1.PCR產物的T-vector克隆方法,應注意哪些操作環節?

2.和其他組結果比較,對本組實驗結果進行分析。

3.對於用高保真Taq DNA聚合酶擴增的PCR產物,如何進行克隆?