生物化學與分子生物學/PCR實驗技術/RFLP操作步驟
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一、實驗目的
[編輯]學習和掌握限制性片段長度多態性 (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)
遺傳標記的基本原理和檢測方法。
二、實驗原理
[編輯]第一代分子遺傳標記RFLP是根據不同品種（個體）基因組的限制性內切酶的酶切位點鹼基發生突變，或酶切位點之間發生了鹼基的插入、缺失、重排等，導致酶切片段大小發生了變化，這種變化可以通過PCR，酶切及瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，從而可比較不同品種（個體）的DNA水平的差異（即多態性），RFLP已被廣泛用於基因組遺傳圖譜構建、基因定位以及生物進化和分類、遺傳多樣性等研究。
三、儀器、材料與試劑
[編輯]- 儀器： 電熱恆溫水浴鍋，瓊脂糖凝膠電泳及檢測系統
- 材料與試劑：Hind Ⅲ 限制性內切酶，10×M Buffer，待分析的PCR產物，DL2000 DNA Marker，6×Loading Buffer（上樣緩衝液）,滅菌雙蒸水,1.5%瓊脂糖凝膠（注意：含溴化乙錠EB，致癌，請帶手套操作），0.5%TBE（電泳緩衝液）。
四、實驗步驟
[編輯]- Hind Ⅲ 限制性內切酶酶切
反應體積（10μl），在0.2ml Eppendorf管中依次加樣：
| 10xM buffer | 1 μL |
| ddH2O | 5.5 μL |
| Hind Ⅲ | 0.5 μL |
| PCR產物 | 3 μL |
37℃水浴消化2h，消化產物全部用於瓊脂糖檢測。
- 瓊脂糖凝膠電泳
配置1.5%瓊脂糖凝膠，取10μl 酶切產物+1μl 上樣緩衝液,180V恆壓電泳。DNA帶負電荷，電泳時DNA從負極向正極泳動。待泳動至凝膠的1/2~2/3位置時，停止電泳，紫外檢測儀下觀察。