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生物化学与分子生物学/PCR实验技术/RFLP操作步骤

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一、实验目的

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学习和掌握限制性片段长度多态性 (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)

遗传标记的基本原理和检测方法。

二、实验原理

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第一代分子遗传标记RFLP是根据不同品种(个体)基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变,或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失、重排等,导致酶切片段大小发生了变化,这种变化可以通过PCR,酶切及琼脂糖凝胶电泳进行检测,从而可比较不同品种(个体)的DNA水平的差异(即多态性),RFLP已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类、遗传多样性等研究。

三、仪器、材料与试剂

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  1. 仪器: 电热恒温水浴锅,琼脂糖凝胶电泳及检测系统
  2. 材料与试剂:Hind Ⅲ 限制性内切酶,10×M Buffer,待分析的PCR产物,DL2000 DNA Marker,6×Loading Buffer(上样缓冲液),灭菌双蒸水,1.5%琼脂糖凝胶(注意:含溴化乙锭EB,致癌,请带手套操作),0.5%TBE(电泳缓冲液)。

四、实验步骤

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  • Hind Ⅲ 限制性内切酶酶切

反应体积(10μl),在0.2ml Eppendorf管中依次加样:

10xM buffer 1 μL
ddH2O 5.5 μL
Hind Ⅲ 0.5 μL
PCR产物 3  μL

37℃水浴消化2h,消化产物全部用于琼脂糖检测。

  • 琼脂糖凝胶电泳

配置1.5%琼脂糖凝胶,取10μl 酶切产物+1μl 上样缓冲液,180V恒压电泳。DNA带负电荷,电泳时DNA从负极向正极泳动。待泳动至凝胶的1/2~2/3位置时,停止电泳,紫外检测仪下观察。