生物化學與分子生物學/RNA實驗技術/Northern Blot原理及實驗方法

原理

在變性條件下將待檢的RNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳，繼而將在凝膠中的位置轉移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定後再與同位素或其它標記物標記的RNA探針進行反應。

用途

檢測樣品中是否含有基因的轉錄產物（mRNA）及其含量。

實驗方法

儀器、試劑、材料

儀器恆溫水浴箱，電泳儀，凝膠成像系統，真空轉移儀，真空泵，UV交聯儀，雜交爐，恆溫搖床，脫色搖床，漩渦振盪器，分光光度計，微量移液器，電爐（或微波爐），離心管，燒杯，量筒，三角瓶等。
材料總RNA樣品或mRNA樣品，探針模板DNA(25 ng)，尼龍膜
試劑：NorthernMax Kit（Cat. # 1940，Ambion, Inc.），瓊脂糖，DEPC, X光底片，底片暗盒，Random Primer， dNTP Mixture，111 TBq/mmol[a-32P]dCTP，Exo-free Klenow Fragment和10 X Buffer, Sephadex G-50,SDS，雙氧水,滅菌水等。

方法與步驟

用具的準備：180度烤器皿：三角錐瓶、量筒、鑷子、刀片等4小時。電泳槽：清洗梳子和電泳槽，並用雙氧水浸泡過夜，用DEPC水沖洗，乾燥備用。處理DEPC水(2 L)備用。
用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染用RNAZap擦洗梳子，電泳槽，刀片等，然後用DEPC水沖洗二次，去除RNAZap。
制膠：
- 稱取0.36mg瓊脂糖加入三角錐瓶中，加入32.4mlDEPC水後，微波爐加熱至瓊脂糖完全熔解。60℃空氣浴平衡溶液 (需加DEPC水補充蒸發的水分)
- 在通風廚中加入3.6ml的10＊Denaturing Gel buffer，輕輕振盪混勻。注意儘量避免產生氣泡。
- 將熔膠倒入制膠板中，插上梳子如果膠溶液上存在氣泡，可以用熱的玻璃棒或其它方法去除，或將氣泡推到膠的邊緣。註：膠的厚度不能超過0.5cm。
- 膠在室溫下完全凝固後，將膠轉移到電泳槽中，加入1x MOPS Gel Running buffer蓋過膠面約1cm，小心拔出梳子。（配製250ml　1×MOPS Gel Running buffer，在電泳過程中補充蒸發的buffer。）
- 檢查點樣孔。
RNA樣品的製備：在RNA樣品中加入3倍體積的formaldehyde load dye和適當的EB（終濃度為10ug/ml）。混勻後，65℃空氣浴15min。短暫低速離心後，立即放置於冰上5min。
電泳：
- 將RNA樣品小心加到點樣孔中。
- 在5V/cm下跑膠（5ｘ14cm）。在電泳過程中，每隔30min短暫停止電泳，取出膠，混勻兩極的電泳液後繼續電泳。當膠中的溴紛藍（500bp）接近膠的邊緣時終止電泳。
- 紫外燈下，檢驗電泳情況，並用尺子測量18S、28S、溴紛藍到點樣孔的距離。注意不要讓膠在紫外燈下曝光太長時間。
轉膜
- 用3%雙氧水浸泡真空轉移儀後，用DEPC水沖洗。
- 用RNAZap擦洗多孔滲水屏和塑膠屏，用DEPC水沖洗二次。
- 連接真空泵和真空轉移儀，剪取一塊適當大小的膜（膜的四邊緣應大於塑膠屏孔口的5mm），膜在Transfer buffer浸濕5分鐘後，放置在多孔滲水屏的適當位置。
- 蓋上塑膠屏，蓋上外框，扣上鎖。
- 將膠的多餘部分切除，切後的膠四邊緣要能蓋過塑膠屏孔，並至少蓋過邊緣約2mm，以防止漏氣。
- 將膠小心放置在膜的上面，膜與膠之間不能有氣泡。
- 打開真空泵，使壓強維持在50~58mbar；立即將transfer buffer加到膠面和四周。每隔10min在膠面加上1ml transfer buffer，真空轉移2小時。
- 轉膜後，用鑷子夾住膜，於1x MOPS Gel Running buffer中輕輕泡洗10秒，去除殘餘的膠和鹽。
- 用吸水紙吸取膜上多餘的液體後，將膜置於UV交聯儀中自動交聯。
- 將膠和紫外交聯後的膜，在紫外燈下檢測轉移效率。(避免太長的紫外曝光時間)
- 將膜在-20℃保存。
探針的製備
- 在1.5ml離心管中配製以下反應液：模板DNA(25 ng)　　　　1ul
- Random Primer 2ul滅菌水 11ul總體積：14ul
- 95°C加熱3分鐘後，迅速放置於冰冷卻5min。
- 在離心管中按下列順序加入以下溶液：
  - 10×Buffer 2.5ul
  - dNTP Mixture 2.5ul
  - 111 TBq/mmol[a-32P]dCTP 5 ul
  - Exo-free Klenow Fragment 1 ul
- 混勻後（25ul），37°C下反應30分鐘。短暫離心，收集溶液到管底。
- 65°C加熱5min使酶失活。　　　
探針的純化及比活性測定：
- 準備凝膠：將1g凝膠加入30ml的DEPC水中，浸泡過夜。用DEPC水洗滌膨脹的凝膠數次，以除去可溶解的葡聚糖。
- 取1ml一次性注射器，去除內芯推扞，將注射器底部用硅化的玻璃纖維塞住，在注射器中裝填Sephadex G-50凝膠。
- 將注射器放入一支15ml離心管中，注射器把手架在離心管口上。1600g離心4分鐘，凝膠壓緊後，補加Sephadex G-50凝膠懸液，重複此步直至凝膠柱高度達注射器0.9ml刻度處
- 100ul STE緩衝液洗柱，1600g離心4min。重複3次。
- 倒掉離心管中的溶液後，將一去蓋的1.5ml離心管置於管中，再將裝填了Sephadex G-50凝膠的注射器插入離心管中，注射器口對準1.5ml離心管。
- 將標記的DNA樣品加入25 ul STE，取出0.5ul點樣於DE8　paper上，其餘上樣於層析柱上。
- 1600g離心4min，DNA將流出被收集在去蓋的離心管中，而未摻入DNA的dNTP則保留在層析柱中。取0.5ul己純化的探針點樣於DE8-paper.
- 測比活性。
預雜交：
- 將預雜交液在雜交爐中68℃預熱，並漩渦使未溶解的物質溶解。
- 加入適當的ULRAhyb到雜交管中(以100cm2膜面積加入10mlULRAhyb雜交液)，42℃預雜交4 hr。
探針變性：
- 用10 mM EDTA將探針稀釋10倍。
- 90℃熱處理稀釋後探針10min後，立即放置於冰上5min。
- 短暫離心，將溶液收集到管底。
雜交：
- 加入0.5ml ULTRAhyb到變性的探針中，混勻後，將探針加到預雜交液中。
- 42℃雜交過夜（14~24hr）。雜交完後，將雜交液收集起來於－20℃保存。
洗膜：
- 低嚴緊性洗膜：加入Low Stringency Wash Solution#1 (100cm2膜面積加入20ml洗膜溶液)，室溫下，搖動洗膜5min兩次。
- 高嚴緊性洗膜：加入High Stringency Wash Solution#2 (100cm2膜面積加入20ml洗膜溶液)，42℃ 搖動洗膜20min兩次。
曝光：
- 將膜從洗膜液中取出，用保鮮膜包住，以防止膜乾燥。
- 檢查膜上放射性強度，估計曝光時間
- 將X光底片覆蓋與膜上，曝光
- 沖洗X光底片，掃描記錄結果。
去除膜上的探針：將200ml　0.1%SDS（由DEPC水配製）煮沸後，將膜放入，室溫下讓SDS冷卻到室溫，取出膜，去除多餘的液體，乾燥後，可以保存幾個月。
雜交結果
- 操作應該小心，但不必緊張。用於RNA電泳、轉膜的所有器械、用具均須處理以除去RNAse酶，以免樣品的降解。轉膜時，注意膜和多孔滲水屏之間不要有氣泡