生物化學與分子生物學/RNA實驗技術/Northern Blot原理及實驗方法

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原理[編輯]

在變性條件下將待檢的RNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳,繼而將在凝膠中的位置轉移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上,固定後再與同位素或其它標記物標記的RNA探針進行反應。

用途[編輯]

檢測樣品中是否含有基因的轉錄產物(mRNA)及其含量。

實驗方法[編輯]

儀器、試劑、材料[編輯]

  1. 儀器恆溫水浴箱,電泳儀,凝膠成像系統,真空轉移儀,真空泵,UV交聯儀,雜交爐,恆溫搖床,脫色搖床,漩渦振盪器,分光光度計,微量移液器,電爐(或微波爐),離心管,燒杯,量筒,三角瓶等。
  2. 材料總RNA樣品或mRNA樣品,探針模板DNA(25 ng),尼龍膜
  3. 試劑:NorthernMax Kit(Cat. # 1940,Ambion, Inc.),瓊脂糖,DEPC, X光底片,底片暗盒,Random Primer, dNTP Mixture,111 TBq/mmol[a-32P]dCTP,Exo-free Klenow Fragment和10 X Buffer, Sephadex G-50,SDS,雙氧水,滅菌水等。

方法與步驟[編輯]

  1. 用具的準備:180度烤器皿:三角錐瓶、量筒、鑷子、刀片等4小時。電泳槽:清洗梳子和電泳槽,並用雙氧水浸泡過夜,用DEPC水沖洗,乾燥備用。處理DEPC水(2 L)備用。
  2. 用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染用RNAZap擦洗梳子,電泳槽,刀片等,然後用DEPC水沖洗二次,去除RNAZap。
  3. 制膠:
    • 稱取0.36mg瓊脂糖加入三角錐瓶中,加入32.4mlDEPC水後,微波爐加熱至瓊脂糖完全熔解。60℃空氣浴平衡溶液 (需加DEPC水補充蒸發的水分)
    • 在通風廚中加入3.6ml的10*Denaturing Gel buffer,輕輕振盪混勻。注意儘量避免產生氣泡。
    • 將熔膠倒入制膠板中,插上梳子如果膠溶液上存在氣泡,可以用熱的玻璃棒或其它方法去除,或將氣泡推到膠的邊緣。註:膠的厚度不能超過0.5cm。
    • 膠在室溫下完全凝固後,將膠轉移到電泳槽中,加入1x MOPS Gel Running buffer蓋過膠面約1cm,小心拔出梳子。(配製250ml 1×MOPS Gel Running buffer,在電泳過程中補充蒸發的buffer。)
    • 檢查點樣孔。
  4. RNA樣品的製備:在RNA樣品中加入3倍體積的formaldehyde load dye和適當的EB(終濃度為10ug/ml)。混勻後,65℃空氣浴15min。短暫低速離心後,立即放置於冰上5min。
  5. 電泳:
    • 將RNA樣品小心加到點樣孔中。
    • 在5V/cm下跑膠(5x14cm)。在電泳過程中,每隔30min短暫停止電泳,取出膠,混勻兩極的電泳液後繼續電泳。當膠中的溴紛藍(500bp)接近膠的邊緣時終止電泳。
    • 紫外燈下,檢驗電泳情況,並用尺子測量18S、28S、溴紛藍到點樣孔的距離。注意不要讓膠在紫外燈下曝光太長時間。
  6. 轉膜
    • 用3%雙氧水浸泡真空轉移儀後,用DEPC水沖洗。
    • 用RNAZap擦洗多孔滲水屏和塑膠屏,用DEPC水沖洗二次。
    • 連接真空泵和真空轉移儀,剪取一塊適當大小的膜(膜的四邊緣應大於塑膠屏孔口的5mm),膜在Transfer buffer浸濕5分鐘後,放置在多孔滲水屏的適當位置。
    • 蓋上塑膠屏,蓋上外框,扣上鎖。
    • 將膠的多餘部分切除,切後的膠四邊緣要能蓋過塑膠屏孔,並至少蓋過邊緣約2mm,以防止漏氣。
    • 將膠小心放置在膜的上面,膜與膠之間不能有氣泡。
    • 打開真空泵,使壓強維持在50~58mbar;立即將transfer buffer加到膠面和四周。每隔10min在膠面加上1ml transfer buffer,真空轉移2小時。
    • 轉膜後,用鑷子夾住膜,於1x MOPS Gel Running buffer中輕輕泡洗10秒,去除殘餘的膠和鹽。
    • 用吸水紙吸取膜上多餘的液體後,將膜置於UV交聯儀中自動交聯。
    • 將膠和紫外交聯後的膜,在紫外燈下檢測轉移效率。(避免太長的紫外曝光時間)
    • 將膜在-20℃保存。
  7. 探針的製備
    • 在1.5ml離心管中配製以下反應液:模板DNA(25 ng)    1ul
    • Random Primer 2ul滅菌水 11ul總體積:14ul
    • 95°C加熱3分鐘後,迅速放置於冰冷卻5min。
    • 在離心管中按下列順序加入以下溶液:
      • 10×Buffer 2.5ul
      • dNTP Mixture 2.5ul
      • 111 TBq/mmol[a-32P]dCTP 5 ul
      • Exo-free Klenow Fragment 1 ul
    • 混勻後(25ul),37°C下反應30分鐘。短暫離心,收集溶液到管底。
    • 65°C加熱5min使酶失活。   
  8. 探針的純化及比活性測定:
    • 準備凝膠:將1g凝膠加入30ml的DEPC水中,浸泡過夜。用DEPC水洗滌膨脹的凝膠數次,以除去可溶解的葡聚糖。
    • 取1ml一次性注射器,去除內芯推扞,將注射器底部用矽化的玻璃纖維塞住,在注射器中裝填Sephadex G-50凝膠。
    • 將注射器放入一支15ml離心管中,注射器把手架在離心管口上。1600g離心4分鐘,凝膠壓緊後,補加Sephadex G-50凝膠懸液,重複此步直至凝膠柱高度達注射器0.9ml刻度處
    • 100ul STE緩衝液洗柱,1600g離心4min。重複3次。
    • 倒掉離心管中的溶液後,將一去蓋的1.5ml離心管置於管中,再將裝填了Sephadex G-50凝膠的注射器插入離心管中,注射器口對準1.5ml離心管。
    • 將標記的DNA樣品加入25 ul STE,取出0.5ul點樣於DE8 paper上,其餘上樣於層析柱上。
    • 1600g離心4min,DNA將流出被收集在去蓋的離心管中,而未摻入DNA的dNTP則保留在層析柱中。取0.5ul己純化的探針點樣於DE8-paper.
    • 測比活性。
  9. 預雜交:
    • 將預雜交液在雜交爐中68℃預熱,並漩渦使未溶解的物質溶解。
    • 加入適當的ULRAhyb到雜交管中(以100cm2膜面積加入10mlULRAhyb雜交液),42℃預雜交4 hr。
  10. 探針變性:
    • 用10 mM EDTA將探針稀釋10倍。
    • 90℃熱處理稀釋後探針10min後,立即放置於冰上5min。
    • 短暫離心,將溶液收集到管底。
  11. 雜交:
    • 加入0.5ml ULTRAhyb到變性的探針中,混勻後,將探針加到預雜交液中。
    • 42℃雜交過夜(14~24hr)。雜交完後,將雜交液收集起來於-20℃保存。
  12. 洗膜:
    • 低嚴緊性洗膜:加入Low Stringency Wash Solution#1 (100cm2膜面積加入20ml洗膜溶液),室溫下,搖動洗膜5min兩次。
    • 高嚴緊性洗膜: 加入High Stringency Wash Solution#2 (100cm2膜面積加入20ml洗膜溶液),42℃ 搖動洗膜20min兩次。
  13. 曝光:
    • 將膜從洗膜液中取出,用保鮮膜包住,以防止膜乾燥。
    • 檢查膜上放射性強度,估計曝光時間
    • 將X光底片覆蓋與膜上,曝光
    • 沖洗X光底片,掃描記錄結果。
  14. 去除膜上的探針:將200ml 0.1%SDS(由DEPC水配製)煮沸後,將膜放入,室溫下讓SDS冷卻到室溫,取出膜,去除多餘的液體,乾燥後,可以保存幾個月。
  15. 雜交結果
    • 操作應該小心,但不必緊張。用於RNA電泳、轉膜的所有器械、用具均須處理以除去RNAse酶,以免樣品的降解。轉膜時,注意膜和多孔滲水屏之間不要有氣泡