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生物化學與分子生物學/RNA實驗技術/Trizol法提取總RNA

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原理

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Trizol試劑是直接從細胞或組織中提取總RNA的試劑。在樣品裂解或勻漿過程中,Trizol能保持RNA的完整性。加入氯仿後離心,樣品分成水樣層和有機層。RNA存在於水樣層中。收集上面的水樣層後,RNA可以通過異丙醇沉澱來還原。在除去水樣層後,樣品中的DNA和蛋白也能相繼以沉澱的形式還原。乙醇沉澱能析出中間層的DNA,在有機層中加入異丙醇能析出有機層的蛋白。共純化DNA對於樣品間標準化RNA的產量十分有用。

Trizol試劑可用於小量樣品(50~100mg組織,5×106細胞),也可用於大量樣品(≥1g組織或≥107細胞),對人、動物、植物和細菌、血液提取都適用,可同時處理大量不同樣品。一個小時內即可完成反應,提取的總RNA沒有DNA和蛋白質污染,可用於Northern blot、RT-PCR、Dot blot、RNase保護分析等。

本試劑為紅顏色,便於區分水相和有機相,同時最大限度的保持RNA的完整性。

保存條件

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2~8℃避光保存12個月。

實驗前需要準備的試劑

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Trizol,氯仿,異丙醇,75%乙醇(用RNase-Free水配製),RNase-Free水。

實驗前需要準備的物品

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1ml注射器,1.5ml EP管(DEPC處理過),大、中、小號槍頭(DEPC處理)

樣品前處理注意點

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  1. 選擇新鮮血液,不得超過4小時。
  2. 選擇新鮮組織,生長旺盛的組織。
  3. 選擇新鮮的幼嫩組織。
  4. 選擇處於生長旺盛的時期收集細胞。

RNA純化要求

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  1. 純化後不應存在對酶(如逆轉錄酶)有抑制作用的物質。
  2. 排除有機溶劑和金屬離子的污染。
  3. 蛋白質、多糖和脂類分子等的污染降到最低程度。
  4. 排除DNA分子的污染。

RNA提取的注意事項

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  1. 杜絕外源酶的污染。
    1. 嚴格戴好口罩,手套。
    2. 實驗所涉及的離心管,Tip頭,移液器杆,電泳槽,實驗台面等要徹底處理。
    3. 實驗所涉及的試劑/溶液,尤其是水,必須確保RNase-Free。
  2. 阻止內源酶的活性。
    1. 選擇合適的勻漿方法。
    2. 選擇合適的裂解液。
    3. 控制好樣品的起始量。
  3. 明確自己的提取目的。
    1. 任何裂解液系統在接近樣品最大起始量時,提取成功率急劇下降。
    2. RNA提取成功的唯一經濟的標準是後續實驗的一次成功,而不是得率。

Rnase污染的10大來源

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  1. 手指頭
  2. 槍頭
  3. 水/緩衝液
  4. 實驗台面
  5. 內源Rnase
  6. RNA樣品
  7. 質粒提取
  8. RNA保存
  9. 陽離子(Ca,Mg)
  10. 後續實驗所用的酶

流程

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  1. 樣品處理:
    • 培養細胞:收穫細胞1~5×107,加入1ml Trizol(異硫氰酸胍/酚)(在冰箱旁邊取出白細胞即刻加入Trizol),混勻;用1ml注射器反覆抽取(約30次)以破裂細胞及剪切DNA,室溫靜置5min(使核酸蛋白複合物完全分離)。
    • 組織:取50~100mg組織(新鮮或-70℃及液氮中保存的組織均可)置1.5ml EP管中,加入1ml Trizol充分勻漿,室溫靜置5min。
  2. 可選步驟:如樣品中含有較多蛋白質,脂肪,多糖或胞外物質(肌肉,植物結節部分等)可於2-8℃10000×g離心10分鐘,取上清。離心得到的沉澱中包括細胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。處理脂肪組織時,上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
  3. 加入0.2ml氯仿,劇烈振盪15~30s,靜置2~3min。
  4. 4℃離心,12000g×15min。樣品分為三層:底層為黃色有機相,上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中,水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
  5. 小心吸取上清至一新的DEPC處理過的1.5ml EP管中(如要分離DNA和蛋白質可保留有機相),加入0.5ml異丙醇,將管中液體輕輕混勻,室溫靜置10min。
  6. 4℃離心,12000g×10min。離心前看不出RNA沉澱,離心後在管側和管底出現膠狀沉澱。
  7. 棄上清,於沉澱中加入75%乙醇(冰冷)1ml,振搖,充分洗滌沉澱。
  8. 4℃離心,12000g×5min。
  9. 棄上清,短暫離心,小心吸取棄去上清。
  10. 加入適量(20μl)DEPC (Rnase Free)H20溶解RNA(65℃促溶10~15min)。
  11. 取2μl進行電泳,其餘-80℃保存。