生物化学与分子生物学/RNA实验技术/Trizol法提取总RNA

原理

Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。在样品裂解或匀浆过程中，Trizol能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的形式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能析出有机层的蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。

Trizol试剂可用于小量样品（50~100mg组织，5×106细胞），也可用于大量样品（≥1g组织或≥107细胞），对人、动物、植物和细菌、血液提取都适用，可同时处理大量不同样品。一个小时内即可完成反应，提取的总RNA没有DNA和蛋白质污染，可用于Northern blot、RT-PCR、Dot blot、RNase保护分析等。

本试剂为红颜色，便于区分水相和有机相，同时最大限度的保持RNA的完整性。

保存条件

2~8℃避光保存12个月。

实验前需要准备的试剂

Trizol，氯仿，异丙醇，75%乙醇（用RNase-Free水配制），RNase-Free水。

实验前需要准备的物品

1ml注射器，1.5ml EP管（DEPC处理过），大、中、小号枪头（DEPC处理）

样品前处理注意点

1. 选择新鲜血液，不得超过4小时。
2. 选择新鲜组织，生长旺盛的组织。
3. 选择新鲜的幼嫩组织。
4. 选择处于生长旺盛的时期收集细胞。

RNA纯化要求

1. 纯化后不应存在对酶（如逆转录酶）有抑制作用的物质。
2. 排除有机溶剂和金属离子的污染。
3. 蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降到最低程度。
4. 排除DNA分子的污染。

RNA提取的注意事项

1. 杜绝外源酶的污染。
   1. 严格戴好口罩，手套。
   2. 实验所涉及的离心管，Tip头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。
   3. 实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保RNase-Free。
2. 阻止内源酶的活性。
   1. 选择合适的匀浆方法。
   2. 选择合适的裂解液。
   3. 控制好样品的起始量。
3. 明确自己的提取目的。
   1. 任何裂解液系统在接近样品最大起始量时，提取成功率急剧下降。
   2. RNA提取成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功，而不是得率。

Rnase污染的10大来源

1. 手指头
2. 枪头
3. 水/缓冲液
4. 实验台面
5. 内源Rnase
6. RNA样品
7. 质粒提取
8. RNA保存
9. 阳离子（Ca，Mg）
10. 后续实验所用的酶

流程

1. 样品处理：
   • 培养细胞：收获细胞1~5×107，加入1ml Trizol（异硫氰酸胍/酚）（在冰箱旁边取出白细胞即刻加入Trizol），混匀；用1ml注射器反复抽取（约30次）以破裂细胞及剪切DNA，室温静置5min（使核酸蛋白复合物完全分离）。
   • 组织：取50~100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml EP管中，加入1ml Trizol充分匀浆，室温静置5min。
2. 可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
3. 加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15~30s，静置2~3min。
4. 4℃离心，12000g×15min。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
5. 小心吸取上清至一新的DEPC处理过的1.5ml EP管中（如要分离DNA和蛋白质可保留有机相），加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。
6. 4℃离心，12000g×10min。离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。
7. 弃上清，于沉淀中加入75%乙醇（冰冷）1ml，振摇，充分洗涤沉淀。
8. 4℃离心，12000g×5min。
9. 弃上清，短暂离心，小心吸取弃去上清。
10. 加入适量（20μl）DEPC （Rnase Free）H20溶解RNA（65℃促溶10~15min）。
11. 取2μl进行电泳，其余-80℃保存。