細胞生物學/質粒轉染實驗步驟
質粒轉染大腸桿菌
[編輯]材料試劑
[編輯]胰化蛋白腖，酵母提取物，瓊脂，NaCl，NaOH（調pH），氨苄青黴素，卡那黴素，質粒提取試劑盒
儀器
[編輯]高壓滅菌鍋，42℃恆溫水浴鍋，，恆溫搖床（37℃,225rpm），無菌培養板，消毒1.5ml離心管，消毒槍頭，無菌操作台
實驗步驟
[編輯]LB培養基的配製
[編輯]在950 ml去離子水中加入: 胰化蛋白腖 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g 搖動容器直至溶質溶解.用5mol/LNaOH調pH至7.0.用去離子水定容至1L.在15psi高壓下蒸汽滅菌20min.
LB固體培養基及倒板
[編輯]（1）配製：100mlLB培養基加入1.5g瓊脂粉
（2）抗生素的加入：高壓滅菌後，將融化的LB固體培養基置與55℃的水浴中，待培養基溫度降到55℃時（手可觸摸）加入氨苄抗生素（終濃度為50μg/ml），以免溫度過高導致抗生素失效，並充分搖勻。
（3）倒板：一般10ml倒1個板子。培養基倒入培養皿後，打開蓋子，在紫外下照10-15分鐘。
（4）保存：用封口膠封邊，並倒置放於4℃保存，一個月內使用。
- 從-70℃冰箱中取200μl感受態細胞懸液，室溫下使其解凍，解凍後立即置冰上。
- 加入質粒DNA溶液（含量不超過50ng，體積不超過10μl），輕輕搖勻，冰上放置30分鐘後。
- 42℃水浴中熱擊45s/90s，熱擊後迅速置於冰上冷卻3-5分鐘。
- 向管中加入1ml LB液體培養基（不含Amp），混勻後37℃振盪培養1小時，使細菌恢復正常生長狀態，並表達質粒編碼的抗生素抗性基因（Ampr ）。
- 將上述菌液搖勻後取100μl 塗布於含Amp的篩選平板上，正面向上放置半小時，待菌液完全被培養基吸收後倒置培養皿，37℃培養16-24小時。
同時做兩個對照：
對照組1： 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液，其它操作與上面相同。此組正常情況下在含抗生素的LB平板上應沒有菌落出現。
對照組2： 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液，但塗板時只取5μl 菌液塗布於不含抗生素的LB平板上，此組正常情況下應產生大量菌落。
大腸桿菌的擴增
[編輯]- 從LB平板上挑取新活化的單個菌落，接種於3-5ml LB液體培養基中，37℃下振盪培養12小時左右，直至對數生長後期。將該菌懸液以1：100-1：50的比例接種於100ml LB液體培養基中，37℃振盪培養2-3小時至OD600 ＝0.5左右。
- 取上述培養液置於冰中10min，之後轉移到已滅菌的50ml離心管中再於冰上放置5min
- 於4℃離心，2700rmp，10min，棄上清，收集細菌
- 質粒的提取
準備大腸桿菌質粒提取盒和擴增的帶質粒大腸桿菌培養液
[編輯]- 質粒鑑定（瓊脂糖凝膠電泳）
質粒轉染細胞株
[編輯]材料
[編輯]細胞株、質粒、培養基、鏈黴素/青黴素（雙抗）、FCS（小牛血清）、PBS（磷酸鹽緩衝溶液）、胰酶/EDTA消化液、轉染試劑（LipofectamineTM2000）
實驗步驟
[編輯]Ⅰ.準備細胞：
貼壁細胞：轉染前 24 h，在 500 µL無雙抗完全培養基中接種0.5-2×105個細胞，轉染時細胞融合度為80 - 90% 。 ( 註：鋪板時要將細胞消化完全混勻，避免細胞堆積生長。)
II ．對於每個轉染樣品，按下面的方法準備：
（1）用50 µL Opti-MEM稀釋0.8 µg質粒DNA，輕輕吹吸3 - 5 次混勻，室溫下靜置5 min。
（2）輕輕顛倒混勻轉染試劑，用50 µL Opti-MEM 稀釋2.0 µL LipofectamineTM2000，輕輕吹吸3 - 5 次混勻，室溫下靜置5 min。
（3）混合轉染試劑和質粒DNA稀釋液，輕輕吹吸 3 - 5 次混勻，室溫下靜置 20 min。注: 轉染複合物一旦形成，應立即加入培養皿中進行細胞轉染。
（4）轉染複合物加入到24孔細胞板中，100 µL/孔，前後輕搖細胞板混合均勻。
（5）將細胞板置於37℃、5% CO2 培養箱中培養6 h左右，進行換液，換成含10%血清的普通培養基，在37℃，5％CO2孵育箱中繼續培養24h左右。
穩定轉染細胞株的篩選（各種細胞用什麼抗生素篩選呢）
[編輯]從37℃，5％CO2孵育箱中取出培養皿，棄去含轉染試劑的培養基，用PBS沖洗細胞2遍，胰蛋白酶消化，接種1/2的細胞到100 mm培養皿中，加入含500 µg/ml G418的新鮮培養基，每2-3天更換一次新的篩選培養基，每天觀察細胞的死亡情況。當正常細胞完全死亡後，換用新的不含G418的培養基培養。每天觀察細胞生長狀態。在細胞達到60%匯合率時再用含500 µg/ml G418的培養基篩選一次。當細胞達到90%以上匯合率時將細胞轉移至培養瓶中繼續培養（轉染後10-12天左右）。以後每隔4-5天再用含500 µg/ml G418的培養基篩選。直到穩定表達轉染質粒的細胞達到一定數量後可以收集樣品（約轉染後15天左右）。以後繼續培養時加入的G418濃度降一半。