細胞生物學/質體轉染實驗步驟

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質體轉染大腸桿菌[編輯]

材料試劑[編輯]

胰化蛋白腖,酵母提取物,瓊脂,NaCl,NaOH(調pH),氨苄青黴素,卡那黴素,質體提取試劑盒

儀器[編輯]

高壓滅菌鍋,42℃恆溫水浴鍋,,恆溫搖床(37℃,225rpm),無菌培養板,消毒1.5ml離心管,消毒槍頭,無菌操作台

實驗步驟[編輯]

LB培養基的配製[編輯]

在950 ml去離子水中加入:   胰化蛋白腖 10g   酵母提取物 5g   NaCl 10g   搖動容器直至溶質溶解.用5mol/LNaOH調pH至7.0.用去離子水定容至1L.在15psi高壓下蒸汽滅菌20min.

LB固體培養基及倒板[編輯]

(1)配製:100mlLB培養基加入1.5g瓊脂粉  

(2)抗生素的加入:高壓滅菌後,將融化的LB固體培養基置與55℃的水浴中,待培養基溫度降到55℃時(手可觸摸)加入氨苄抗生素(終濃度為50μg/ml),以免溫度過高導致抗生素失效,並充分搖勻。  

(3)倒板:一般10ml倒1個板子。培養基倒入培養皿後,打開蓋子,在紫外下照10-15分鐘。  

(4)保存:用封口膠封邊,並倒置放於4℃保存,一個月內使用。  

  1. 從-70℃冰箱中取200μl感受態細胞懸液,室溫下使其解凍,解凍後立即置冰上。
  2. 加入質體DNA溶液(含量不超過50ng,體積不超過10μl),輕輕搖勻,冰上放置30分鐘後。
  3. 42℃水浴中熱擊45s/90s,熱擊後迅速置於冰上冷卻3-5分鐘。
  4. 向管中加入1ml LB液體培養基(不含Amp),混勻後37℃振盪培養1小時,使細菌恢復正常生長狀態,並表達質體編碼的抗生素抗性基因(Ampr )。
  5. 將上述菌液搖勻後取100μl 塗布於含Amp的篩選平板上,正面向上放置半小時,待菌液完全被培養基吸收後倒置培養皿,37℃培養16-24小時。

同時做兩個對照:

對照組1: 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,其它操作與上面相同。此組正常情況下在含抗生素的LB平板上應沒有菌落出現。

對照組2: 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,但塗板時只取5μl 菌液塗布於不含抗生素的LB平板上,此組正常情況下應產生大量菌落。

大腸桿菌的擴增[編輯]

  1. 從LB平板上挑取新活化的單個菌落,接種於3-5ml LB液體培養基中,37℃下振盪培養12小時左右,直至對數生長後期。將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種於100ml LB液體培養基中,37℃振盪培養2-3小時至OD600 =0.5左右。
  2. 取上述培養液置於冰中10min,之後轉移到已滅菌的50ml離心管中再於冰上放置5min
  3. 於4℃離心,2700rmp,10min,棄上清,收集細菌
  4. 質體的提取

準備大腸桿菌質體提取盒和擴增的帶質體大腸桿菌培養液[編輯]

  1. 質體鑑定(瓊脂糖凝膠電泳)

質體轉染細胞株[編輯]

材料[編輯]

細胞株、質體、培養基、鏈黴素/青黴素(雙抗)、FCS(小牛血清)、PBS(磷酸鹽緩衝溶液)、胰酶/EDTA消化液、轉染試劑(LipofectamineTM2000)

實驗步驟[編輯]

Ⅰ.準備細胞:

貼壁細胞:轉染前 24 h,在 500 µL無雙抗完全培養基中接種0.5-2×105個細胞,轉染時細胞融合度為80 - 90% 。 ( 註:鋪板時要將細胞消化完全混勻,避免細胞堆積生長。)  

II .對於每個轉染樣品,按下面的方法準備:

(1)用50 µL Opti-MEM稀釋0.8 µg質體DNA,輕輕吹吸3 - 5 次混勻,室溫下靜置5 min。

(2)輕輕顛倒混勻轉染試劑,用50 µL Opti-MEM 稀釋2.0 µL LipofectamineTM2000,輕輕吹吸3 - 5 次混勻,室溫下靜置5 min。

(3)混合轉染試劑和質體DNA稀釋液,輕輕吹吸 3 - 5 次混勻,室溫下靜置 20 min。注: 轉染複合物一旦形成,應立即加入培養皿中進行細胞轉染。

(4)轉染複合物加入到24孔細胞板中,100 µL/孔,前後輕搖細胞板混合均勻。

(5)將細胞板置於37℃、5% CO2 培養箱中培養6 h左右,進行換液,換成含10%血清的普通培養基,在37℃,5%CO2孵育箱中繼續培養24h左右。

穩定轉染細胞株的篩選(各種細胞用什麼抗生素篩選呢)[編輯]

從37℃,5%CO2孵育箱中取出培養皿,棄去含轉染試劑的培養基,用PBS沖洗細胞2遍,胰蛋白酶消化,接種1/2的細胞到100 mm培養皿中,加入含500 µg/ml G418的新鮮培養基,每2-3天更換一次新的篩選培養基,每天觀察細胞的死亡情況。當正常細胞完全死亡後,換用新的不含G418的培養基培養。每天觀察細胞生長狀態。在細胞達到60%匯合率時再用含500 µg/ml G418的培養基篩選一次。當細胞達到90%以上匯合率時將細胞轉移至培養瓶中繼續培養(轉染後10-12天左右)。以後每隔4-5天再用含500 µg/ml G418的培養基篩選。直到穩定表達轉染質體的細胞達到一定數量後可以收集樣品(約轉染後15天左右)。以後繼續培養時加入的G418濃度降一半。