生物信息學/單細胞轉錄組在線分析工具

IRIS3：單細胞轉錄組細胞類型分析

IRIS3（單細胞RNA-Seq的特定細胞類型調控因子推斷伺服器）是一個集成的Web伺服器，根據人或小鼠單細胞RNA-Seq數據預測特定細胞類型的調控因子（CTSR，cell-type-specific regulon）。 CTSR能夠可靠地識別和區分細胞類型，用於生物醫學研究的計算或與實驗分析相結合。這些CTSR可以幫助闡明調節機制，並允許可靠地構建以特定細胞類型編碼的全局轉錄調節網絡。 IRIS3包括複雜疾病的層次結構和異質性，基因調節網絡構建以及藥物治療的開發。

IRIS3在線工具：IRIS3。

IRIS3官方教程。

參考文獻：Ma, A., et al. (2020). IRIS3: integrated cell-type-specific regulon inference server from single-cell RNA-Seq, Nucleic Acids Research, gkaa394.

IRIS3的功能

（1）它是一個提供CTSR識別的多合一框架，並結合了細胞類型特異性基因模塊檢測的雙聚類分析和從頭motif預測潛在的新型調節子；

（2）提供信息豐富的註釋，支持對異質性調控機制進行深入分析；

（3）用戶友好的Web界面，無需編程知識，具有簡單的提交過程，全面的scRNA-Seq數據分析功能和高度交互的可視化效果。

（4）改善了調控機制的闡明，並允許可靠地構建以特定細胞類型編碼的全局轉錄調控網絡。

輸入文件

scRNA-Seq基因表達矩陣（必需）和有三個配套的文件（由cell ranger生成），建議使用壓縮文件減少上傳時間。
1. 單個txt，tsv或csv格式的基因表達矩陣，可接受gzip格式壓縮文件。
2. HDF5格式的特徵barcode矩陣。
3. 三個gzip格式的壓縮文件記錄了10X基因組輸出的barcode，特徵和基因表達信息。

標識符可以表示為Gene Symbol（例如HSPA9），Ensembl Gene ID（例如ENSG00000113013）或Transcript ID（例如ENSMUST00000074805）。分別使用org.HS.eg.db R包和org.Mn.eg.db包對人和小鼠的參考基因組的基因進行註釋。

細胞標籤文件（可選）：一個兩列的矩陣，第一列是與基因表達文件完全匹配的細胞名稱，第二列是真實的細胞簇。聚類標識符可以是術語（例如2_cell_stage，4_cell_stage）或數字（例如1,2）。細胞標籤文件將用於評估預測的細胞類型（否則省略評估）和規律推斷（或使用預測的細胞類型）。
自定義基因模塊文件（可選）：一個文本文件，每一列應包含一個基因列表。對於基因模塊（從文獻中收集或通過其他工具生成），這些結果被視為「模塊特異標籤」，並且在最後一個細胞類型旁邊具有單獨的選項卡，以顯示熱圖和結果。除了調控子發現功能外，用戶還可以將感興趣的調控子與上傳的基因模塊的調控子進行比較，尋找相似性。

輸入文件示例：單細胞轉錄組在線分析工具IRIS3_示例數據。

File:Iris pipeline.png

IRIS流程圖

分析流程

IRIS3 pipeline.png

整個流程包括七個步驟：

IRIS3集成了多種最新工具，包括DrImpute，scran，Seurat，QUBIC2，DMINDA2和MEME。這些工具在分析領域中享有盛譽或已被證明具有最佳性能。

步驟一：數據預處理

首先通過提交頁面加載基因表達數據，然後創建Seurat對象。去除超過99.9％的細胞中具有零值的基因和具有少於200個非零表達基因的細胞，以提高分析性能。數據標準化狀態是通過將整數視為未標準化的值自動檢測的，而十進制已標準化。未標準化的數據將由scran標準化。缺失數據補全步驟可以根據用戶的選擇進行。最後，將表達式值進行對數log歸一化log⁡(x + 1)以重新縮放數據。

第二步：細胞聚類

在Seurat（版本3.1）中可以預測細胞類型，並且大多數參數都設置為默認值。根據Seurat教程的建議，將主成分的數量設置為10，並為每個測試數據集繪製圖形。通常，前十個主要成分可以覆蓋數據變異的85％-95％，這些信息足夠進行特徵選擇。然後，使用前十個主要成分進行聚類，聚類解像度為0.8（Seurat中均為默認值）。值得注意的是，本研究以下各節中提到的細胞類型稱為計算預測的細胞聚類。此步驟的輸出是兩列單細胞標籤，將在步驟IV和其他軌跡分析中使用。

第三步：基因模塊檢測

使用QUBIC2對來自步驟I的預處理數據進行分析，來檢測基因模塊。 QUBIC的先前版本已被證明是有效和高效地捕獲高比例的二聚類（通過功能性生物通路富集的二聚類）中表現最好的方法之一。與QUBIC相比，QUIBIC2的性能有所提高。每個已識別的二聚體代表在特定細胞子集下的一組共表達的基因。

QUBIC2中解決了兩個獨特的功能：（1）它可以識別所有具有統計意義的雙聚類，包括具有所謂「縮放模式」的雙聚類，這個問題是相當具有挑戰性的；（2）算法有效地解決了一般的雙聚類問題，能夠在幾分鐘內在數千種條件下解決成千上萬個基因的雙聚類問題。

三個主要參數控制IRIS3中的雙聚類：

雙聚類的重疊程度（從0到1）。 0表示沒有重疊，而1表示完全重疊。默認值為0.7。
雙簇識別的最大數量。默認值為500。較小的值可以充分減少運行時間，但可以標識較少的類別。
最小細胞數是雙聚類塊的最小列寬。預設值為20。

步驟四：確定活性基因模塊

如果雙簇中的細胞與細胞類型簇中的細胞高度一致，認為雙簇的組成基因會響應特定細胞類型中的調節信號。為了一致性，使用步驟II中識別出的二聚體的細胞成分（或上傳的細胞類型）和步驟III中識別出的二聚體的細胞成分進行超幾何富集測試。通過乘以N（cell type）x N（bicluster）將Bonferroni調整為與特定細胞類型相對應的bicluster的p值，其中N（cell type）表示細胞類型的數量，N（bicluster）表示bicluster的總數。如果超幾何檢驗結果顯著（adj.p <0.05），則認為雙峰在相應的細胞類型中是活躍的。在雙細胞群中的基因為該細胞類型的活性基因模塊。

步驟五：主題查找和比較

對於每種細胞類型，然後通過MEME和DMINDA2中的從頭motif預測功能在活性基因模塊中鑑定motif。使用hg38 / mm10參考基因組提取每個基因的上游啟動子序列（默認為1,000 bp，可在提交頁面上由用戶設置）。人和小鼠的參考基因組分別整合在BSgenome.Hsapiens.UCSC.hg38和BSgenome.Mmusculus.UCSC.mm10 R程序包中。

第六步：調節Regruon

使用TOMTOM將特定細胞類型中識別出的motif聚類，並用HOCOMOCO數據庫（V11）中最匹配的已知motif進行註釋。刪除q值大於0.05的HOCOMOCO目標來過濾匹配的條目。 q值是最小的錯誤發現率，在該標準下，觀察到的相似性是重要的。對於每個motif簇，相應的非冗餘基因列表被命名為regulon。

第七步：CTSR推論

對於每個調節子，細胞中的調節子活性得分（RAS）是基於所有相關基因在細胞中表達值的水平計算的。然後可以根據細胞類型內部細胞與外部細胞類型相比的RAS熵來計算細胞類型的regulon特異性評分（RSS）。 RSS的範圍是0到1，值越高，表示此regulon在細胞類型中的特異性越高。通過將regulon的RSS與相同細胞類型中隨機選擇的基因集（通過bootstrap方法在regulon中具有相同數目的基因）的RSS進行比較10,000次，可以估算出regulon的RSS的經驗p值。通過將細胞類型中所有已識別的調節子的數目乘以Bonferroni，可以調節Regulon p值。調整後的p值小於0.05的調節子是CTSR。有關調節調節子特異性得分的更多詳細信息，請參見此處。

分析和可視化

可以通過計算silhouette分數來評估預測的細胞類型（來自步驟II），該分數表示與其他聚類相比該細胞與其類型的相似程度。

如果用戶提供了細胞類型，則預測標籤還將通過調整後的蘭德指數（ARI），蘭德指數（RI），福克斯和馬洛斯指數（FMI）和Jaccard指數（JI）進行評估。生成Sankey圖來顯示兩個細胞組的收斂和發散（與Seurat預測對比）。箭頭的寬度與flow成比例顯示。有關細胞類型預測評估計算的更多詳細信息。

針對不同的功能註釋數據庫執行富集分析，識別富集的GO功能，生物學通路等。富集測試由Enrichr執行。 Clustergrammer是由Ma'ayan Lab新開發的功能強大且用戶友好的熱圖繪製工具，支持調控熱圖和相應的基因表達模式。

SC1：scRNA-Seq分析工具

SC1是一個單細胞在線分析工具，包括質控，尋找Top基因，聚類，差異分析，基因富集分析，可視化（互動3D可視化，基因對，小提琴/柱狀圖，熱圖），細胞類型，TCR分析功能。

網址

主站

備用地址

參考文獻：M. Moussa and I.I. Mandoiu, SC1: A Tool for Interactive Web-Based Single Cell RNA-Seq Data Analysis, Proc. 16th International Symposium on Bioinformatics Research and Applications, pp. 389–397, 2020, pdf preprint, publisher url, bibtex