生物化學與分子生物學/原核生物轉錄的模板和酶

RNA的合成 - 原核生物轉錄的模板和酶 - 原核生物的轉錄過程 - 真核生物RNA的合成 - 真核生物前體RNA的加工和降解
RNA的生物合成屬於酶促反應，反應體系中需要DNA模板、NTP(包括ATP、UTP、CTP和GTP)、DNA依賴的RNA聚合酶(DNA-dependent RNA polymerase, 簡稱RNA pol）、其他蛋白質因子及Mg²⁺等。 合成方向為5'→3',核苷酸間的連接方式為3',5'-磷酸二酯鍵。

原核生物轉錄的模板

在DNA分子雙鏈上，一股鏈作為模板，按鹼基配對規律指導轉錄生成RNA, 另一股鏈則不轉錄。用核酸雜交法對模板DNA和轉錄產物RNA進行測定，或對DNA、RNA的鹼基進行序列測定，都可證明DNA分子上的一個基因只有一股鏈可轉錄生成其編碼產物。
作為一個基因載體的一段DNA雙鏈片段，轉錄時作為RNA合成模板的一股單鏈稱為模板鏈(template strand), 相對應的另一股單鏈被稱為編碼鏈(coding strand)。轉錄產物若是mRNA, 則可用作翻譯的模板，決定蛋白質的胺基酸序列。模板鏈既與編碼鏈互補，又與mRNA互補，可見mRNA的鹼基序列除用U代替T外，與編碼鏈是一致的。文獻刊出的各個基因的鹼基序列，為避免繁瑣和便於查對遺傳密碼，一般只寫出編碼鏈。

RNA聚合酶催化RNA合成

RNA聚合酶能從頭啟動RNA鏈的合成

RNA pol催化RNA的轉錄合成。該反應以DNA為模板，以ATP、GTP、UTP和CTP為原料，還需要Mg²⁺作為輔基。RNA合成的化學機制與DNA的複製合成相似。RNA pol通過在RNA的3'-0H端加入核苷酸，延長RNA鏈而合成RNA。3'-0H在反應中是親核基團，攻擊所進入的核苷三磷酸的α-磷酸，並釋放出焦磷酸，總的反應可以表示為：(NMP)_n+NTP→(NMP)_n+1+PPi。
RNA pol和雙鏈DNA結合時活性最高，但是只以雙鏈DNA中的一股DNA鏈為模板。 新加入的核苷酸以Watson-Crick鹼基配對原則和模板的鹼基互補。注意在此與DNA鏈中A配對的是U而不是T。
前述的DNA聚合酶在啟動DNA鏈延長時需要RNA引物存在，而RNA pol能夠在轉錄起點處使兩個核苷酸間形成磷酸二酯鍵，即直接啟動轉錄, 因而RNA鏈的起始合成不需要引物。

RNA聚合酶由多個亞基組成

大腸桿菌(E.coli)的RNA pol是目前研究得比較透徹的分子。這是一個分子量達450kD, 由5種亞基α₂(2個α)、β、β'、ω和σ組成的六聚體蛋白質。
核心酶(core enzyme)由α₂ββ'ω亞基組成。試管內的轉錄實驗（含有模板、酶和底物NTP等）證明，核心酶能夠催化NTP按模板的指引合成RNA。但合成的RNA沒有固定的起始位點。加有σ（sigma）亞基的酶能在特定的起始點上開始轉錄，可見σ亞基的功能是辨認轉錄起始點。σ亞基加上核心酶稱為全酶(holo-enzyme)。活細胞的轉錄起始，是需要全酶的。轉錄延長階段則僅需核心酶。
大腸桿菌內有一些不同的RNA pol全酶，其差異是σ亞基的不同。目前已發現多種σ亞基，並用其分子量命名區別，最常見的是σ70(分子量70kD)。σ70是辨認典型轉錄起始點的蛋白質，大腸桿菌中的絕大多數啟動子可被含有σ70因子的全酶所識別並激活。
將細菌從通常培養的37℃升溫至42℃，細菌可迅速增加一套共17種蛋白質的合成。這些蛋白質被稱為熱激蛋白(heat shock proteins, HSP)。當溫度升至50℃，大部分蛋白質合成已停止，HSP卻能繼續合成。HSP的編碼基因稱為熱激基因(Hsp)。Hsp基因的轉錄起點的上游序列與其他基因不同，因而需另一種σ因子，即σ32(分子量32kD)辨認及啟動其轉錄。可見，σ32是應答熱刺激而被誘導產生的，它本身也屬於一種 HSP。
其他原核生物的RNA pol在結構和功能上均與大腸桿菌相似。抗生素——利福平(rifampicin)可以特異抑制原核生物的RNA pol, 成為抗結核菌治療的藥物。它特異性地結合RNA聚合酶的β亞基。若在轉錄開始後才加入利福平，仍能發揮其抑制轉錄的作用，這說明β亞基是在轉錄全過程都起作用的。

RNA聚合酶結合到啟動子上啟動轉錄

對於整個基因組來講，轉錄是分區段進行的。每一轉錄區段可視為一個轉錄單位，稱為操縱子(operon)。操縱子中包括了若干個基因的編碼區及其調控序列。調控序列中的啟動子 (promoter)是RNA pol結合模板DNA的部位，也是決定轉錄起始點的關鍵部位。原核生物是以RNA pol全酶結合到啟動子上而啟動轉錄的，其中由σ亞基辨認啟動子，其他亞基相互配合。
啟動子結構的闡明回答了轉錄從哪裏起始這一問題，是轉錄機制研究的重要發現。為了確認RNA pol在基因組的結合位點，研究中採用了一種巧妙的方法，即RNA pol保護法。在實驗中，先將提取的DNA與提純的RNA pol混合溫育一定時間，再加入核酸外切酶進行反應。結果顯示，大部分DNA鏈被核酸酶水解為核苷酸，但一個40～60bp的DNA片段被保留下來。這段DNA沒有被水解，是因為RNA pol結合在上面，因而受到保護。受保護的DNA位於轉錄起始點的上游，並最終被確認為是被RNA pol辨認和緊密結合的區域，是轉錄起始調節區。
對數百個原核生物基因操縱子轉錄上游區段進行的鹼基序列分析，證明RNA pol保護區存在共有序列。以開始轉錄的5'-端第一位核苷酸位置轉錄起點(transcription start site, TSS; 或initiator)為+1，用負數表示其上游的鹼基序號，發現-35和-10區A-T配對比較集中。-35區的最大一致性序列是TTGACA。-10區的一致性序列TATAAT ,是在 1975年由D.Pribnow發現的，故被稱為Pribnow盒(Pribnow box)。-35區與-10區相隔16～18個核苷酸，-10區與轉錄起點相距6或7個核苷酸。
A-T配對相對集中，表明該區段的DNA容易解鏈，因為A-T配對只有兩個氫鍵維繫。比較RNA pol結合不同區段測得的平衡常數，發現RNA pol結合在-1 0區比結合在-35區更為牢固。把RNA pol分子大小與DNA鏈長度進行比較，可確定其結合DNA鏈時分子的跨度。從這些結果推論出：-35區是RNA pol對轉錄起始的識別序列(recognition sequence)。結合識別序列後，RNA pol向下游移動，達到Pribnow盒，與DNA形成相對穩定的RNA pol-DNA複合物，就可以開始轉錄。