生物化學與分子生物學/抑癌基因

癌基因和抑癌基因 - 癌基因 - 抑癌基因
抑癌基因也稱腫瘤抑制基因(tumor suppressor gene) , 是防止或阻止癌症發生的基因。與原癌基因活化誘發癌變的作用相反，抑癌基因的部分或全部失活可顯著增加癌症發生風險。抑癌基因對細胞增殖起負性調控作用，包括抑制細胞增殖、調控細胞周期檢查點、促進凋亡和參與 DNA損傷修復等。

抑癌基因對細胞增殖起負性調控作用

抑癌基因的發現源於20世紀60年代H.Harris的雜合細胞致癌性研究。他將癌細胞株與正常細胞融合得到的雜合細胞接種動物，發現並不產生腫瘤，提示正常細胞中有能抑制腫瘤發生的基因，即抑癌基因。用化學物質誘發的腫瘤及自發發生的腫瘤的細胞與正常細胞製備雜合細胞也可重複出上述結果，並且與腫瘤的組織起源無關，表明上述結果有普遍意義。將不具致癌性的雜合細胞體外培養傳代，可從中分離出具有致癌性的子代細胞。比較兩種雜合細胞，發現致癌性的子代雜合細胞丟失了來自正常細胞的一條或幾條染色體。將正常人類細胞的單條染色體逐一融合在腫瘤細胞中，也可分離到無致癌性的雜合細胞。這些結果說明細胞中含有各種不同的抑癌基因，分佈在不同的染色體上，可以分別抑制不同組織起源的癌細胞的致癌作用。
隨着20世紀70年代基因克隆技術的建立，RB、TP53等一系列抑癌基因得以克隆和鑑定。必須指出，最初在某種腫瘤中發現的抑癌基因，並不意味其與別的腫瘤無關；恰恰相反，在多種組織來源的腫瘤細胞中往往可檢測出同一抑癌基因的突變、缺失、重排、表達異常等，這正說明抑癌基因的變異構成某些共同的致癌途徑。總體來說，抑癌基因對細胞增殖起負性調控作用，其編碼產物的功能有：抑制細胞增殖；抑制細胞周期進程；調控細胞周期檢查點；促進凋亡；參與DNA損傷修復。

抑癌基因有多種失活機制

抑癌基因的失活與原癌基因的激活一樣，在腫瘤發生中起着非常重要的作用。但癌基因的作用是顯性的，而抑癌基因的作用往往是隱性的。原癌基因的兩個等位基因只要激活一個就能發揮促癌作用，而抑癌基因則往往需要兩個等位基因都失活才會導致其抑癌功能完全喪失。1971年，Knudson A以視網膜母細胞瘤(retinoblastoma)為模型進行統計學分析研究，發現散發性單側視網膜母細胞瘤的發病需要抑癌基因（即後來命名為RB的基因）的兩次體細胞突變，從而提出二次打擊假說(two-hit hypothesis)。
但也有一些抑癌基因只失活其等位基因中的一個拷貝就會引起腫瘤發生，即其一個正常的等位基因拷貝不足以完全發揮其抑癌功能，稱為單倍體不足型抑癌基因(haploinsufficient tumor suppressor gene), 如p27^Kipl基因。還有一些抑癌基因，如TP53基因，當其一個等位基因突變失活後，其表達的 p53突變蛋白則能抑制另一個正常等位基因產生的野生型即正常p53蛋白的功能，這種基因突變稱為顯性負效突變(dominant negative mutation)。
抑癌基因失活的方式常見有以下三種。

基因突變常導致抑癌基因編碼的蛋白質功能喪失或降低

抑癌基因發生突變後，會造成其編碼的蛋白質功能或活性喪失或降低，進而導致癌變。這種突變屬於功能失去突變(loss-of-function mutation)。最典型的例子就是抑癌基因TP53的突變，目前已經發現TP53基因在超過一半以上的人類腫瘤中發生了突變。

雜合性丟失導致抑癌基因徹底失活

雜合性(heterozygosity)是指同源染色體在一個或一個以上基因座存在不同的等位基因的狀態。雜合性丟失(loss of heterozygosity, LOH)則是指一對雜合的等位基因變成純合狀態的現象。雜合性丟失是腫瘤細胞中常見的異常遺傳學現象，發生雜合性丟失的區域也往往就是抑癌基因所在的區域。
雜合性丟失導致抑癌基因失活的經典實例就是抑癌基因RB的失活。1986年，將視網膜母細胞瘤的RB基因成功克隆後就發現，RB等位基因的一個拷貝往往是通過生殖細胞突變遺傳給後代，也就是說，此時後代的體細胞中RB等位基因就呈現為雜合子狀態，即：一個為突變失活的不具有抑癌功能的RB等位基因，另一個為仍具有抑癌功能的正常RB等位基因。而當因為某些原因導致正常的RB等位基因丟失即雜合性丟失時，抑癌基因RB則徹底失活，失去其抑癌作用，從而導致視網膜母細胞瘤。

啟動子區甲基化導致抑癌基因表達抑制

真核生物基因啟動子區域CpG島的甲基化修飾對於調節基因轉錄活性至關重要，甲基化程度與基因表達呈負相關。很多抑癌基因的啟動子區CpG島呈高度甲基化(hypermethylation)狀態，從而導致相應的抑癌基因不表達或低表達。例如，約70%的散發腎癌病人中存在抑癌基因VHL啟動子區甲基化失活現象；在家族性腺瘤息肉所致的結腸癌中，APC基因啟動子區因高度甲基化使轉錄受到抑制，導致APC基因失活，進而引起仕連環蛋白在細胞內的積累，從而促進癌變發生。

抑癌基因在腫瘤發生發展中具有重要作用

抑癌基因的失活在腫瘤發生發展中發揮着重要作用，此處以TP53、RB、PTEN三個抑癌基因為例，簡要介紹抑癌基因的作用機制。

RB主要通過調控細胞周期檢查點而發揮其抑癌功能

RB基因失活不僅與視網膜母細胞瘤及骨肉瘤有關，在許多散發性腫瘤，如50%～85%的小細胞性肺癌、10%～30%乳腺癌、膀胱癌和前列腺癌中都發現有RB基因失活。
RB基因位於染色體13q14, 有2 7個外顯子，mRNA長 4.7kb, 編碼的蛋白質為105kD。RB蛋白的磷酸化狀態及其與其他蛋白質結合，與它的功能密切相關。去磷酸化（或低磷酸化）形式為活性型，能促進細胞分化，抑制細胞增殖。實驗表明，將RB基因導入視網膜母細胞瘤細胞或成骨肉瘤細胞，這些惡性細胞的生長受到抑制。
RB的磷酸化程度受細胞周期中增殖調控蛋白質的直接控制，包括隨着細胞周期不同時相的轉換，其濃度也隨之發生變化的細胞周期蛋白(cyclin) , 以及受到這些蛋白質調節的蛋白激酶。這些蛋白激酶被稱為細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase , CDK)。細胞進入G₁期時RB處於低磷酸化狀態，而低磷酸化的RB使得細胞不能通過G₁/S期檢查點(checkpoint)。該檢查點是哺乳動物細胞周期的重要檢查點，只有通過該檢查點後，細胞周期才能進入下一步運轉，進行DNA合成和細胞分裂，故又稱為限制點(restriction point) , 以符號"R"表示。只有在細胞增殖信號通過依賴於cyclin D1的激酶CDK4的活化導致RB磷酸化後，高磷酸化的RB方允許細胞跨過G₁/S期檢查點。因此，低磷酸化的RB在G₁期特異的磷酸化是細胞從G₁期進入S期的關鍵。
低磷酸化RB對細胞周期的負調節作用是通過與轉錄因子E2F-l的結合而實現的。低磷酸化RB的口袋結構域能結合E2F-l並使之失活，S期必需的基因產物如二氫葉酸還原酶、胸苷激酶、 DNA聚合酶α等的合成因而受限，細胞周期的進展受到抑制。而高磷酸化的RB不能與E2F-l結合，將導致這些基因的開放，促進細胞通過G_l-S關卡。RB基因的缺失使得細胞喪失了該關卡的「守衛」，細胞周期進程失控，細胞異常增殖。

TP53主要通過調控DNA損傷應答和誘發細胞凋亡而發揮其抑癌功能

TP53基因是目前研究最多的、也是迄今發現在人類腫瘤中發生突變最廣泛的抑癌基因。50%～60%的人類各系統腫瘤中發現有TP53基因突變。
人的TP53基因定位於17pl3,全長16～20kb, 含有11個外顯子，轉錄2.8kb的mRNA,編碼蛋白為p53,具有轉錄因子活性。TP53基因是迄今為止發現的與人類腫瘤相關性最高的基因。過去一直把它當成一種癌基因，直至1989年才知道起癌基因作用的是突變的p53,後來證實野生型p53是一種抑癌基因。
TP53基因的表達產物p53蛋白由393個胺基酸殘基構成，在體內以四聚體形式存在。p53蛋白屬於轉錄因子，包含有典型的轉錄激活結構域、DNA結合結構域、寡聚結構域、富含脯氨酸區和核定位序列等多個結構域或序列，這也是 p53發揮其生物學功能的分子結構基礎。多數TP53基因突變都發生在編碼其DNA結合結構域的序列中。
正常情況下，細胞中p53蛋白含量很低，因其半衰期只有20～30分鐘，所以很難檢測出來，但在細胞增殖與生長時，可升高5～100倍以上。野生型 p53蛋白在維持細胞正常生長、抑制惡性增殖中起着重要作用，因而被冠以「基因組衛士」稱號。當細胞受電離輻射或化學試劑等作用導致DNA損傷時，p53表達水平迅速升高，同時p53蛋白中包含的一些絲氨酸殘基被磷酸化修飾而被活化。活化的p53從細胞質移位至細胞核內，調控大量下游靶基因的轉錄而發揮其生物學功能。例如，p53的靶基因之一p21 可阻止細胞通過G₁/S期檢查點，使其停滯於G期；另一靶基因GADD45 的產物是DNA修復蛋白。這就使DNA受損的細胞不再分裂，並且修復損傷以維持基因組的穩定性。如果修復失敗，p53蛋白就會通過激活一些靶基因如BAX 的轉錄而啟動細胞凋亡，阻止有癌變傾向突變細胞的生成。p53突變後，則DNA損傷不能得到有效修復並不斷累積，導致基因組不穩定，進而導致腫瘤發生。

PTEN主要通過抑制Pl3K/AKT信號通路而發揮其抑癌功能

PTEN基因(phosphatase and tensin hornolog deleted on chromosome ten gene, 第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基基因）是繼TP53基因後發現的另一個與腫瘤發生關係密切的抑癌基因。人的PTEN 基因定位於10q23.3, 共有9個外顯子和8個內含子，編碼5.15kb的mRNA，PTEN蛋白由403個胺基酸殘基組成，分子量約為56kD。PTEN主要包括3個結構功能域。

N端磷酸酶結構區 由N端1～185位胺基酸殘基組成，第5外顯子編碼，與蛋白酪氨酸磷酸酶及蛋白質絲／蘇氨酸磷酸酶催化區的核心模體(HCXXGXGRXG)同源，是PTEN發揮腫瘤抑制活性的主要功能區。PTEN的N-端175個胺基酸序列可與整合素、酪氨酸激酶、黏着斑激酶(focaladhesion kinase, FAK)等形成複合物，共同參與細胞生長的調節。此外，PTEN還能與肌動蛋白纖維細絲局部黏附，在腫瘤浸潤、轉移、血管生成中也起一定作用。
C2區 由186～351位胺基酸殘基構成，介導蛋白質與脂質的結合。PTEN通過C2區結合於膜磷脂，參與PTEN在胞膜的有效定位和胞內細胞信號轉導。與其他信號蛋白不同，這一結合過程不需要Ca²⁺參與。磷酸酶區和C2區之間有廣泛的相互作用界面，提示C2區可能具有催化作用。已有實驗證實，對C2區進行誘變，可導致PTEN的腫瘤抑制活性降低。
C端區 由羧基端的50個胺基酸殘基組成，包括PDZ(PSD-95/Dlg/ZOI同源區）結合序列(Thr/Ser-X-Val-COOH)和2個PEST序列(350～375,376～396), 對於調節自身的穩定性和酶活性具有重要作用。研究表明PEST序列與蛋白質降解有關，PDZ結合位點與細胞生長調控有關。PDZ區在腫瘤的發生中也可以缺失突變，雖不影響磷酸酶功能，但對腫瘤細胞錨定非依賴性生長的抑制作用顯著降低。

PTEN 是迄今發現的第一個具有雙特異(dual specificity)磷酸酶活性的抑癌基因，其編碼產物 PTEN具有磷脂醯肌醇-3,4 ,5-三磷酸 3-磷酸酶活性，催化水解磷脂醯肌醇-3,4,5-三磷酸 (PIP₃)的 3-磷酸成為PIP₂,而 PIP₃是胰島素、表皮生長因子等細胞生長因子的信號轉導分子，從而抑制 PI3K/AKT信號通路，起到負性調節細胞生長增殖的作用。PTEN也能催化黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)的去磷酸化反應，而抑制由整聯蛋白(integrin)介導的細胞鋪展和遷移，因而PTEN的失活也與腫瘤細胞的轉移密切相關。

腫瘤發生發展涉及癌基因和抑癌基因的共同參與

目前普遍認為腫瘤的發生、發展是多個原癌基因和抑癌基因突變累積的結果，經過起始、啟動、促進和癌變幾個階段逐步演化而產生。

腫瘤發生發展涉及多種相關基因的改變

在基因水平上，或通過外界致癌因素，或由於細胞內環境的惡化，突變基因數目增多，基因組變異逐步擴大；在細胞水平上則要經過永生化、分化逆轉、轉化等多個階段，細胞周期失控細胞的生長特性逐步得到強化。結果是相關組織從增生、異型變、良性腫瘤、原位癌發展到浸潤癌和轉移癌。例如，結腸癌的發生發展過程涉及數種基因的變化: ①上皮細胞過度增生階段：涉及家族性腺瘤性息肉基因FAP(familial adenomatous polyposis)、結腸癌突變基因MCC(mutated in colorectal carcinoma)的突變或缺失；②早期腺瘤階段：與DNA的低甲基化有關；③中期腺瘤階段：涉及K-RAS 基因突變；④晚期腺瘤階段：涉及結腸癌缺失基因DCC的丟失；⑤腺癌階段：涉及TP53 基因缺失；⑥轉移癌階段：涉及NM23(nonmetastatic protein 23)基因的突變、血管生長因子基因表達增高等。

細胞周期和細胞凋亡的分子調控是腫瘤進展的關鍵

1、原癌基因和抑癌基因是調控細胞周期進程的重要基因 細胞周期調控體現在細胞周期驅動和細胞周期監控兩個方面，後者的失控與腫瘤發生發展的關係最為密切。細胞周期監控機制由DNA損傷感應機制、細胞生長停滯機制、DNA修復機制和細胞命運決定機制等構成。細胞一旦發生DNA 損傷或複製錯誤，將會啟動DNA損傷應激機制，經由各種信號轉導途徑使細胞停止生長，修復損傷的DNA。如果DNA損傷得到完全修復，細胞周期可進入下一個時相，正常完成一個細胞分裂周期；倘若DNA損傷修復失敗，細胞凋亡機制將被啟動，損傷細胞進入凋亡，從而避免DNA損傷帶到子代細胞，維持了組織細胞基因組的穩定性，避免腫瘤發生的潛在可能。
腫瘤細胞的最基本特徵是細胞的失控性增殖，而失控性增殖的根本原因就是細胞周期調控機制的破壞，包括驅動機制和監控機制的破壞。監控機制破壞可發生在損傷感應、生長停滯、DNA修復和凋亡機制的任何一個環節上，結果將導致細胞基因組不穩定，突變基因數量增加，這些突變的基因往往就是癌基因和抑癌基因。同時，很大一部分的原癌基因和抑癌基因又是細胞周期調控機制的組成部分。因此，在腫瘤發展過程中，監控機制的異常會使細胞周期調控機制進一步惡化，並導致細胞周期驅動機制的破壞，細胞周期的驅動能力異常強化，細胞進入失控性生長狀態，從而細胞出現癌變性生長。
2、原癌基因和抑癌基因還是調控細胞凋亡的重要基因 細胞除了生長、增殖和分化等之外，還存在細胞死亡現象，如程序性細胞死亡或凋亡。有些抑癌基因的過量表達可誘導細胞發生凋亡，而與細胞生存相關的原癌基因的激活則可抑制凋亡，細胞凋亡異常與腫瘤的發生發展密切相關。現已明確，細胞凋亡在腫瘤發生、胚胎發育、免疫反應、腫瘤免疫逃逸、神經系統發育、組織細胞代謝等過程中起重要作用。
值得注意的是，近年來的研究也發現，一些非編碼RNA, 如miRNA,在腫瘤發生過程中也具有重要作用。總之，腫瘤分子生物學的進展已經深刻地改變了人們對腫瘤發生和生命現象的認識，並使腫瘤研究從以揭示腫瘤病因和尋找腫瘤治療方法為目的的單項研究，轉變為以研究整個生命現象和全面揭示生命分子機制為目的的綜合性系統研究。腫瘤分子生物學必將在整個生命醫學研究中發揮越來越重要的作用。