生物化學與分子生物學/原核生物DNA複製過程

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DNA的生物合成 - DNA複製的基本規律 - DNA複製的酶學和拓撲學 - 原核生物DNA複製過程 - 真核生物DNA複製過程 - 逆轉錄
原核生物染色體DNA和質體等都是共價環狀閉合的DNA分子,複製過程具有共同的特點,但並非絕對相同,下面以大腸桿菌DNA複製為例,介紹原核生物DNA複製的過程和特點。

複製的起始[編輯]

起始是複製中較為複雜的環節,在此過程中,各種酶和蛋白質因子在 複製起點處裝配引發體,形成複製叉併合成RNA引子。

DNA的解鏈[編輯]

  • 複製有固定起點 複製不是在基因組上的任何部位隨機起始。E.coli上有一個固定的複製起點,稱為oriC, 跨度為245bp,鹼基序列分析發現這段DNA上有5組由9個鹼基對組成的串聯重複序列,形成Dna A結合位點,和3組由13個鹼基對組成的串聯重複序列的富含AT(AT rich)區。DNA雙鏈中,AT間的配對只有2個氫鍵維繫,故富含AT的部位容易發生解鏈。
  • DNA解鏈需多種蛋白質參與 DNA的解鏈過程由DnaA、DnaB 、DnaC三種蛋白質共同參與完成。DnaA蛋白是一同源四聚體,負責辨認並結合於oriC的串聯重複序列(AT區) 上。 然後,幾個 DnaA蛋白互相靠近,形成DNA-蛋白質複合體結構,促使 AT區的DNA解鏈。DnaB 蛋白(解旋酶)在 DnaC蛋白的協同下,結合併沿解鏈方向移動,使雙鏈解開足夠用於複製的長度,並且逐步置換出 DnaA蛋白。此時,複製叉已初步形成。

SSB(單鏈結合蛋白)此時結合到DNA單鏈上,在一定時間內使複製叉保持適當的長度,有利於核苷酸依模板摻入。

  • 解鏈過程中需要DNA拓撲異構酶 解鏈是是一種高速的反向旋轉,其下游勢必發生打結現象。拓撲異構酶Ⅱ通過切斷、旋轉和再連接的作用,實現DNA超螺旋的轉型,即把正超螺旋變為負超螺旋。實驗證明:負超螺旋DNA比正超螺旋有更好的模板作用。從道理上也是可以理解的:扭得不那麼緊的超螺旋當然比過度扭緊的更容易解開成單鏈。

引子合成和起始複合物的形成[編輯]

複製起始過程需要先合成引子(primer) , 引子是由引子酶(primase)催化合成的短鏈RNA分子。
母鏈DNA解成單鏈後,不會立即按照模板序列將dNTP聚合為DNA子鏈。這是因為DNA poa不具備催化兩個游離dNTP之間形成磷酸二酯鍵的能力,只能催化核酸片段的3'-OH末端與dNTP間的聚合。但RNA聚合酶不需要3'-OH便可催化NTP的聚合,而引子酶屬於RNA聚合酶,故複製起始部位合成的短鏈引子RNA 為DNA的合成提供3'-OH末端,在DNA pol催化下逐一加入dNTP而形成DAN子鏈。
引子酶是複製起始時催化RNA引子合成的酶。它不同於催化轉錄的RNA聚合酶。利福平(rifampicin)是轉錄用RNA pol的特異性抑制劑,而引子酶對利福平不敏感。
在DNA雙鏈解鏈基礎上,形成了DnaB、DnaC蛋白與DNA複製起點相結合的複合體,此時引子酶進入。此時形成含有解旋酶DnaB、DnaC、引子酶和DNA的複製起始區域共同構成的起始複合物結構,該結構在噬菌體ΦX系統也稱為引發體(primosome)。起始複合物蛋白質組分在 DNA 鏈上的移動需由 ATP 供給能量。 在適當位置上,引子酶依據模板的鹼基序列,從5'→3'方向催化 NTP(不是dNTP) 的聚合,生成短鏈的 RNA 引子。
引子長度約為 5~10 個核苷酸不等。 引子合成的方向也是自 5'-端至 3'-端。 已合成的引子必然留有 3'-0H 末端,此時就可進入 DNA 的複製延長。在DNA pol Ⅲ催化下,引子末端與新配對進入的dNTP生成磷酸二酯鍵。新鏈每次反應後亦留有3'-0H, 複製就可繼續進行下去。

DNA鏈的延長[編輯]

複製中DNA鏈的延長在DNA pol催化下進行。原核生物催化延長反應的酶是DNA pol Ⅲ。底物dNTP的α-磷酸基團與引子或延長中的子鏈上3'-0H反應後,dNMP的 3'-0H又成為鏈的末端,使下一個底物可以摻入。複製沿5'→3'延長,指的是子鏈合成的方向。前導鏈沿著5'→3'方向連續延長,而後隨鏈沿著5'→3'方向呈不連續延長。
在同一個複製叉上,前導鏈的複製先於後隨鏈,但兩鏈是在同一個DNA pol Ⅲ催化下進行延長的。這是因為後隨鏈的模板DNA可以摺疊或繞成環狀,進而與前導鏈正在延長的區域對齊。由於後隨鏈作360°繞轉,前導鏈和後隨鏈的延長方向和延長點都處在DNA pol Ⅲ核心酶的催化位點上。解鏈方向就是酶的前進方向,亦即複製叉向前伸展的方向。因為複製叉上解開的模板單鏈走向相反,所以其中一股出現不連續複製的岡崎片段。
DNA複製延長速度相當快。以E.coli 為例,營養充足、生長條件適宜時,細菌20分鐘即可繁殖一代。E.coli 基因組DNA全長約4600kb,依此計算,每秒鐘能摻入的核苷酸達3800個。

複製的終止[編輯]

複製的終止過程,包括切除引子、填補空缺和連接切口。原核生物基因是環狀DNA,複製是雙向複製,從起點開始各進行180°,同時在終止點上匯合。
由於複製的半不連續性,在後隨鏈上出現許多岡崎片段。每個岡崎片段上的引子是RNA而不是DNA。複製的完成還包括去除RNA引子和換成DNA ,最後把DNA片段連接成完整的子鏈。實際上此過程在子鏈延長中已陸續進行,不必等到最後的終止才連接。
引子的水解靠細胞核內的DNA pol I, 水解後留下空隙(gap)。空隙的填補由DNA pol I而不是DNA pol Ⅲ催化,從5'-端向3'-端用 dNTP為原料生成相當於引子長度的DNA鏈。dNTP的摻入要有3'-0H, 在原引子相鄰的子鏈片段提供3'-0H繼續延伸,就是說,由後複製的片段延長以填補先複製片段的引子空隙。填補至足夠長度後,還是留下相鄰的3'-0H和5'-P的缺口 (nick)。缺口由連接酶連接。按照這種方式,所有的岡崎片段在環狀DNA上連接成完整的DNA子鏈。前導鏈也有引子水解後的空隙,在環狀DNA最後複製的3'-0H端繼續延長,即可填補該空隙及連接,完成基因組DNA的整個複製過程。