生物化學與分子生物學/蛋白質組學

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組學與系統生物醫學 - 基因組學 - 轉錄物組學 - 蛋白質組學 - 代謝組學 - 其他組學 - 系統生物醫學及其應用
蛋白質是生物功能的主要載體。蛋白質組 (proteome) 是指細胞、組織或機體在特定時間和空間上表達的所有蛋白質。蛋白質組學(proteomics) 以所有這些蛋白質為研究對象,分析細胞內動態變化 的蛋白質組成、表達水平與修飾狀態,了解蛋白質之間的相互作用與聯繫,並在整體水平上闡明蛋白質調控的活動規律,故又稱為全景式蛋白質表達譜(global protein expression profile) 分析。

蛋白質組學研究細胞內所有蛋白質的組成及其活動規律[編輯]

蛋白質組學的研究主要涉及兩個方面:一是蛋白質組表達模式的研究,即結構蛋白質組學(structural proteomics); 二是蛋白質組功能模式的研究,即功能蛋白質組學 (functional proteomics)。由於蛋白質的種類和數量總是處在一個新陳代謝的動態過程中,同一細胞的不同周期,其所表達的蛋白質是不同的;同一細胞在不同的生長條件(正常、疾病或外界環境刺激)下,所表達的蛋白質也是不同的。以上動態變化增加了蛋白質組研究的複雜性。

蛋白質鑑定是蛋白質組學的基本任務[編輯]

  1. 蛋白質種類和結構鑑定是蛋白質組研究的基礎 細胞在特定狀態下表達的所有蛋白質都是蛋白質組學的研究對象。一般利用二維電泳和多維色譜並結合生物質譜、蛋白質印跡、蛋白質晶片等技術,對蛋白質進行全面的種類和結構鑑定研究。
  2. 翻譯後修飾的鑑定有助於蛋白質功能的闡明 很多mRNA表達產生的蛋白質要經歷翻譯後修飾如磷酸化、糖基化等過程。翻譯後修飾是蛋白質功能憫控的重要方式,因此,研究蛋白質翻譯後修飾對闡明蛋白質的功能具有重要意義。

蛋白質功能確定是蛋白質組學的根本目的[編輯]

  1. 各種蛋白質均需要鑑定其基本功能特性 蛋白質功能研究包括蛋白質定位研究,基因過表達/基因敲除(減)技術分析蛋白質活性,此外,分析酶活性和確定酶底物,細胞因子的生物學作用分析,配體-受體結合分析等也屬蛋白質功能研究範疇。
  2. 蛋白質相互作用研究是認識蛋白質功能的重要內容 細胞中的各種蛋白質分子往往形成蛋白質複合物共同執行各種生命活動。蛋白質-蛋白質相互作用是維待細胞生命活動的基本方式。要深入研究所有蛋白質的功能,理解生命活動的本質,就必須對蛋白質-蛋白質相互作用有一個清晰的了解,包括受體與配體的結合、信號轉導分子間的相互作用及其機制等。目前研究蛋白質相互作用常用的方法有酵母雙雜交、親和層析、免疫共沉澱、蛋白質交聯、螢光共振能量轉移等。

二維電泳、液相分離和質譜是蛋白質組研究的常用技術[編輯]

目前常用的蛋白質組研究主要有兩條技術路線,一是基於雙向凝膠電泳 (two-dimensional gel electrophoresis ,2-DE) 分離為核心的研究路線:混合蛋白質首先通過 2-DE 分離,然後進行膠內酶解,再用質譜(mass spectroscopy, MS) 進行鑑定; 二是基於液相色譜(liquid chromatography, LC) 分離為核心的技術路線:混合蛋白質先進行酶解,經色譜或多維色譜分離後,對肽段進行串聯質譜分析以實現蛋白質的鑑定。其中,質譜是研究路線中不可缺少的技術。

2-DE-MALDI-MS根據等電點和分子量分離鑑定蛋白質[編輯]

1、2-DE是分離蛋白質的有效方法 2-DE是分離蛋白質最基本的方法,其原理是蛋白質在高壓電場作用下先進行等電聚焦(isoelectric focusing, IEF)電泳,利用蛋白質分子的等電點不同使蛋白質得以分離;隨後進行SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE),使依據等電點分離的蛋白質再按分子蜇大小進行再次分離。目前2-DE的解析度可達到10 000個蛋白質點。
2、MALDI-MS鑑定2-DE膠內蛋白質點 MS是通過測定樣品離子的質荷比(m/z)來進行成分和結構分析的方法。2-DE膠內蛋白質點的鑑定常採用基質輔助雷射解吸附離子化(matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI)技術。 MALDI作為一種離子源,通常用飛行時間 (time of flight, TOF)作為質量分析器,所構成的儀器稱為MALDI-TOF-MS。MALDI的基本原理是將樣品與小分子基質混合共結晶,當用不同波長的雷射照射晶體時,基質分子所吸收能量轉移至樣品分子,形成帶電離子並進入MS進行分析,飛行時間與(m/z)1/2成正比。MALDI-TOF-MS適合微量樣品(fmol~amol)的分析。
利用質譜技術鑑定蛋白質主要通過兩種方法:①肽質量指紋圖譜(peptide mass fingerprinting, PMF)和資料庫搜索匹配。蛋白質經過酶解成肽段後,獲得所有肽段的分子質量,形成一個特異的PMF圖譜,通過資料庫搜索與比對,便可確定待分析蛋白質分子的性質。②肽段串聯質譜(MS/MS)的信息與資料庫搜索匹配。通過MS技術獲得蛋白質一段或數段多肽的MS/MS信息(胺基酸序列)並通過資料庫檢索來鑑定該蛋白質。混合蛋白質酶解後的多肽混合物直接通過(多維)液相色譜分離,然後進入MS進行分析。質譜儀通過選擇多個肽段離子進行MS/MS分析,獲得有關序列的信息,並通過資料庫搜索匹配進行鑑定。

LC-ESI-MS通過液相層析技術分離鑑定蛋白質[編輯]

基於LC-ESI-MS的蛋白質組研究技術通常稱之為鳥槍法(shotgun)策略。其特點是組合多種蛋白質或肽段分離手段,首選不同的層析技術,實現蛋白質或多膚的高效分離,並與 MS/MS技術結合,實現多肽序列的準確鑑定。

  1. 層析分離膚混合物 從組織中提取的目標蛋白質混合物首先進行選擇性酶解,獲得肽段混合物,然後進行二維液相分離。一維液相分離一般採用強陽離子交換層析,利用肽段所帶電荷數差異進行分離;二維分離常常選擇納升反相層析,利用肽段的疏水性差異進行分離。
  2. 電噴霧串聯質譜鑑定肽段 在肽段鑑定中,納升級液相層析(nano-LC)常與電噴霧串聯質譜(electrospray ionization, ESI)相連。ESI的基本原理是利用高電場使MS進樣端的毛細管柱流出的液滴帶電,帶電液滴在電場中飛向與其所帶電荷相反的電勢一側。液滴在飛行過程中變得細小而呈噴霧狀,被分析物離子化成為帶單電荷或多電荷的離子,使被分析物得以鑑定。 nano-LC-ESI-MS可以實現對複雜肽段混合物的在線分離、柱上富集與同步序列測定,一次分析可以鑑定的蛋白質數目超過1000個,而結合多維層析分離技術,可以利用鳥槍法一次實驗鑑定上萬個蛋白質。