生物化学与分子生物学/蛋白质组学

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蛋白质是生物功能的主要载体。蛋白质组 (proteome) 是指细胞、组织或机体在特定时间和空间上表达的所有蛋白质。蛋白质组学(proteomics) 以所有这些蛋白质为研究对象，分析细胞内动态变化的蛋白质组成、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，并在整体水平上阐明蛋白质调控的活动规律，故又称为全景式蛋白质表达谱(global protein expression profile) 分析。

蛋白质组学研究细胞内所有蛋白质的组成及其活动规律

蛋白质组学的研究主要涉及两个方面：一是蛋白质组表达模式的研究，即结构蛋白质组学(structural proteomics); 二是蛋白质组功能模式的研究，即功能蛋白质组学 (functional proteomics)。由于蛋白质的种类和数量总是处在一个新陈代谢的动态过程中，同一细胞的不同周期，其所表达的蛋白质是不同的；同一细胞在不同的生长条件（正常、疾病或外界环境刺激）下，所表达的蛋白质也是不同的。以上动态变化增加了蛋白质组研究的复杂性。

蛋白质鉴定是蛋白质组学的基本任务

蛋白质种类和结构鉴定是蛋白质组研究的基础 细胞在特定状态下表达的所有蛋白质都是蛋白质组学的研究对象。一般利用二维电泳和多维色谱并结合生物质谱、蛋白质印迹、蛋白质芯片等技术，对蛋白质进行全面的种类和结构鉴定研究。
翻译后修饰的鉴定有助于蛋白质功能的阐明 很多mRNA表达产生的蛋白质要经历翻译后修饰如磷酸化、糖基化等过程。翻译后修饰是蛋白质功能悯控的重要方式，因此，研究蛋白质翻译后修饰对阐明蛋白质的功能具有重要意义。

蛋白质功能确定是蛋白质组学的根本目的

各种蛋白质均需要鉴定其基本功能特性 蛋白质功能研究包括蛋白质定位研究，基因过表达/基因敲除（减）技术分析蛋白质活性，此外，分析酶活性和确定酶底物，细胞因子的生物学作用分析，配体-受体结合分析等也属蛋白质功能研究范畴。
蛋白质相互作用研究是认识蛋白质功能的重要内容 细胞中的各种蛋白质分子往往形成蛋白质复合物共同执行各种生命活动。蛋白质-蛋白质相互作用是维待细胞生命活动的基本方式。要深入研究所有蛋白质的功能，理解生命活动的本质，就必须对蛋白质-蛋白质相互作用有一个清晰的了解，包括受体与配体的结合、信号转导分子间的相互作用及其机制等。目前研究蛋白质相互作用常用的方法有酵母双杂交、亲和层析、免疫共沉淀、蛋白质交联、荧光共振能量转移等。

二维电泳、液相分离和质谱是蛋白质组研究的常用技术

目前常用的蛋白质组研究主要有两条技术路线，一是基于双向凝胶电泳 (two-dimensional gel electrophoresis ,2-DE) 分离为核心的研究路线：混合蛋白质首先通过 2-DE 分离，然后进行胶内酶解，再用质谱(mass spectroscopy, MS) 进行鉴定; 二是基于液相色谱(liquid chromatography, LC) 分离为核心的技术路线：混合蛋白质先进行酶解，经色谱或多维色谱分离后，对肽段进行串联质谱分析以实现蛋白质的鉴定。其中，质谱是研究路线中不可缺少的技术。

2-DE-MALDI-MS根据等电点和分子量分离鉴定蛋白质

1、2-DE是分离蛋白质的有效方法 2-DE是分离蛋白质最基本的方法，其原理是蛋白质在高压电场作用下先进行等电聚焦(isoelectric focusing, IEF)电泳，利用蛋白质分子的等电点不同使蛋白质得以分离；随后进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),使依据等电点分离的蛋白质再按分子蜇大小进行再次分离。目前2-DE的分辨率可达到10 000个蛋白质点。
2、MALDI-MS鉴定2-DE胶内蛋白质点 MS是通过测定样品离子的质荷比(m/z)来进行成分和结构分析的方法。2-DE胶内蛋白质点的鉴定常采用基质辅助激光解吸附离子化(matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI)技术。 MALDI作为一种离子源，通常用飞行时间 (time of flight, TOF)作为质量分析器，所构成的仪器称为MALDI-TOF-MS。MALDI的基本原理是将样品与小分子基质混合共结晶，当用不同波长的激光照射晶体时，基质分子所吸收能量转移至样品分子，形成带电离子并进入MS进行分析，飞行时间与(m/z)^1/2成正比。MALDI-TOF-MS适合微量样品(fmol～amol)的分析。
利用质谱技术鉴定蛋白质主要通过两种方法：①肽质量指纹图谱(peptide mass fingerprinting, PMF)和数据库搜索匹配。蛋白质经过酶解成肽段后，获得所有肽段的分子质量，形成一个特异的PMF图谱，通过数据库搜索与比对，便可确定待分析蛋白质分子的性质。②肽段串联质谱(MS/MS)的信息与数据库搜索匹配。通过MS技术获得蛋白质一段或数段多肽的MS/MS信息（氨基酸序列）并通过数据库检索来鉴定该蛋白质。混合蛋白质酶解后的多肽混合物直接通过（多维）液相色谱分离，然后进入MS进行分析。质谱仪通过选择多个肽段离子进行MS/MS分析，获得有关序列的信息，并通过数据库搜索匹配进行鉴定。

LC-ESI-MS通过液相层析技术分离鉴定蛋白质

基于LC-ESI-MS的蛋白质组研究技术通常称之为鸟枪法(shotgun)策略。其特点是组合多种蛋白质或肽段分离手段，首选不同的层析技术，实现蛋白质或多肤的高效分离，并与 MS/MS技术结合，实现多肽序列的准确鉴定。

层析分离肤混合物 从组织中提取的目标蛋白质混合物首先进行选择性酶解，获得肽段混合物，然后进行二维液相分离。一维液相分离一般采用强阳离子交换层析，利用肽段所带电荷数差异进行分离；二维分离常常选择纳升反相层析，利用肽段的疏水性差异进行分离。
电喷雾串联质谱鉴定肽段 在肽段鉴定中，纳升级液相层析(nano-LC)常与电喷雾串联质谱(electrospray ionization, ESI)相连。ESI的基本原理是利用高电场使MS进样端的毛细管柱流出的液滴带电，带电液滴在电场中飞向与其所带电荷相反的电势一侧。液滴在飞行过程中变得细小而呈喷雾状，被分析物离子化成为带单电荷或多电荷的离子，使被分析物得以鉴定。 nano-LC-ESI-MS可以实现对复杂肽段混合物的在线分离、柱上富集与同步序列测定，一次分析可以鉴定的蛋白质数目超过1000个，而结合多维层析分离技术，可以利用鸟枪法一次实验鉴定上万个蛋白质。