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細胞生物學/MTT法測定細胞相對數和相對活力

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MTT法測定細胞相對數和相對活力[編輯]

原理[編輯]

噻唑蘭,簡稱MTT,可透過細胞膜進入細胞內,活細胞線粒體中的琥珀脫氫酶能使外源性MTT還原為難溶於水的藍紫色的Formazan結晶並沉積在細胞中,結晶物能被二甲基亞碸(DMSO)溶解,用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值,可間接反映細胞數量。

試劑材料準備與實驗儀器[編輯]

1)對數生長期細胞

2)受試因素(藥物)

3)MTT:以PBS配製成5mg /ml,抽濾除菌,保存在4˚C

4)DMSO(二甲基亞碸)

5)96孔板

6)酶聯免疫檢測儀

7)細胞培養箱

實驗步驟(適用於貼壁細胞)[編輯]

1)收集對數期細胞,調整細胞懸液濃度,分於96孔板,1×104/孔,細胞濃度可以調整。

2)置37℃、5%CO2溫箱培養使細胞貼壁。

3)加入不同濃度的藥物,如1、5、10、40、50、80、160、320mg/ml的藥物,時間依據實驗需要,一般3天。

4)小心吸去上清,PBS輕輕洗滌,再次離心,棄上清。

5)每孔加入180 ul新鮮RPMI 1640培養液,再加入20 ul MTT溶液(5 mg/ml,即0.5%MTT),繼續培養4 h。

6)終止培養(可離心,1000 rpm,10 min),小心吸去孔內培養液。

7)每孔加入150 ul二甲基亞碸(也可以用酸化異丙醇,10%SDS代替),置搖床上低速振盪10 min,使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光值。

8)同時設置調零孔(培養基、MTT、二甲基亞碸),對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞碸),每組設定3復孔。

結果統計學處理[編輯]

所有數值以x±s表示,應用SPSS軟體進行方差分析,p<0.05時為相差顯著,p<0.01時為相差非常顯著。可以以時間為橫軸,光吸收值為縱軸繪製細胞生線,專門公式求IC50。或計算抑制率。

注意事項與常見問題[編輯]

1)實驗時應設置調零孔,對照孔,加藥孔。調零孔加培養基、MTT、二甲基亞碸。 對照孔和加藥孔都要加細胞、培養液、MTT、二甲基亞碸,不同的是對照加溶解藥物的介質,而加藥組加入不同濃度的藥物。

2)每孔中的細胞數可以根據細胞生長的速度調整,並進行預實驗調整濃度,太多敏感性降低,太少觀察不到差異。

3)貼壁細胞加MTT前吸掉培養液,懸浮細胞可以不吸除培養液,再加入0.5%MTT,量為20ul/孔。

4)如果不使用96孔板,培養基超過100 ml,MTT按照10%的比例加入。

5)MTT一般4度保存兩周,注意避光保存,或配製成5mg/ml保存在-20度長期保存,避免反覆凍融,最好小劑量分裝,用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解,配製完後可過濾一下。

6)對於DMSO,溶解後呈紫(紅)色,490nm有最大吸收值;而對於SDS和酸化異丙醇,則選用570nm,並且建議以655nm作為參考波長。

7)96孔板在培養箱中,由於濕度不夠,而培養箱由於具有一定的溫度,使得邊緣的孔水分蒸發較快,導致培養基中各種成分濃度變化增大,導致細胞狀態不同。對於這種現象,要保證培養箱中的濕度,減少開關培養箱的次數和時間。

8)注意細胞懸液一定要混勻,已避免細胞沉澱下來,導致每孔中的細胞數量不等,可以每接幾個就要再混勻一下。

9)沒有去掉上清直接加DMSO,沉澱會很難溶解。加DMSO前要把液體吸掉,但培養液里的紫色結晶可能會吸去,也可在倒之前先用平板離心機離心96孔板,2000r,5分鐘,然後吸掉上清。加入DMSO後可用排槍反覆抽吸助溶,溶解後儘快檢測。

10)為了減少誤差,培養板的四邊孔只加培養基或只接種細胞,而不作為指標檢測孔。

11)除置搖床上低速振盪10 min,使結晶物充分溶解外,可用槍頭吹打,加快溶解,效果亦可;或放入37度放孵箱15分鐘溶解結晶。

12)關於如何計算IC50 方法有多種

(1)改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)

(2)Bliss法:自己查閱書籍

(3) IC50計算軟體,見下面附件(暫時找不到了)

(4)自己用EXCEL做趨勢線來求IC50,關於LD50的方法與此相似!

(5)在線求IC50或EC50:http://chiryo.phar.nagoya-cu.ac.jp/javastat/JavaStat-j.htm

13)計算抑制率,公式[(對照-本底)-(給藥-本底)]/(對照-本底)*100%.