細胞生物學/MTT法測定細胞相對數和相對活力

MTT法測定細胞相對數和相對活力

噻唑蘭，簡稱MTT，可透過細胞膜進入細胞內，活細胞線粒體中的琥珀脫氫酶能使外源性MTT還原為難溶於水的藍紫色的Formazan結晶並沉積在細胞中，結晶物能被二甲基亞碸（DMSO）溶解，用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映細胞數量。

1）對數生長期細胞

2）受試因素（藥物）

3）MTT：以PBS配製成5mg /ml，抽濾除菌，保存在4˚C

4）DMSO（二甲基亞碸）

5）96孔板

6）酶聯免疫檢測儀

7）細胞培養箱

1）收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，分於96孔板，1×104/孔，細胞濃度可以調整。

2）置37℃、5%CO2溫箱培養使細胞貼壁。

3）加入不同濃度的藥物，如1、5、10、40、50、80、160、320mg/ml的藥物，時間依據實驗需要，一般3天。

4）小心吸去上清，PBS輕輕洗滌，再次離心，棄上清。

5）每孔加入180 ul新鮮RPMI 1640培養液，再加入20 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續培養4 h。

6）終止培養（可離心，1000 rpm，10 min），小心吸去孔內培養液。

7）每孔加入150 ul二甲基亞碸（也可以用酸化異丙醇，10%SDS代替），置搖床上低速振盪10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光值。

8）同時設置調零孔（培養基、MTT、二甲基亞碸），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞碸），每組設定3復孔。

所有數值以x±s表示，應用SPSS軟體進行方差分析，p<0.05時為相差顯著，p<0.01時為相差非常顯著。可以以時間為橫軸，光吸收值為縱軸繪製細胞生線，專門公式求IC50。或計算抑制率。

1）實驗時應設置調零孔，對照孔，加藥孔。調零孔加培養基、MTT、二甲基亞碸。對照孔和加藥孔都要加細胞、培養液、MTT、二甲基亞碸，不同的是對照加溶解藥物的介質，而加藥組加入不同濃度的藥物。

2）每孔中的細胞數可以根據細胞生長的速度調整，並進行預實驗調整濃度，太多敏感性降低，太少觀察不到差異。

3）貼壁細胞加MTT前吸掉培養液，懸浮細胞可以不吸除培養液，再加入0.5%MTT，量為20ul/孔。

4）如果不使用96孔板，培養基超過100 ml，MTT按照10%的比例加入。

5）MTT一般4度保存兩周，注意避光保存，或配製成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反覆凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解，配製完後可過濾一下。

6）對於DMSO，溶解後呈紫（紅）色，490nm有最大吸收值；而對於SDS和酸化異丙醇，則選用570nm，並且建議以655nm作為參考波長。

7）96孔板在培養箱中，由於濕度不夠，而培養箱由於具有一定的溫度，使得邊緣的孔水分蒸發較快，導致培養基中各種成分濃度變化增大，導致細胞狀態不同。對於這種現象，要保證培養箱中的濕度，減少開關培養箱的次數和時間。

8）注意細胞懸液一定要混勻，已避免細胞沉澱下來，導致每孔中的細胞數量不等，可以每接幾個就要再混勻一下。

9）沒有去掉上清直接加DMSO，沉澱會很難溶解。加DMSO前要把液體吸掉，但培養液里的紫色結晶可能會吸去，也可在倒之前先用平板離心機離心96孔板，2000r，5分鐘，然後吸掉上清。加入DMSO後可用排槍反覆抽吸助溶，溶解後儘快檢測。

10）為了減少誤差，培養板的四邊孔只加培養基或只接種細胞，而不作為指標檢測孔。

11）除置搖床上低速振盪10 min，使結晶物充分溶解外，可用槍頭吹打，加快溶解，效果亦可；或放入37度放孵箱15分鐘溶解結晶。

12）關於如何計算IC50 方法有多種

(1)改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)

(2)Bliss法:自己查閱書籍

(3) IC50計算軟體，見下面附件（暫時找不到了）

(4)自己用EXCEL做趨勢線來求IC50，關於LD50的方法與此相似！

(5)在線求IC50或EC50：http://chiryo.phar.nagoya-cu.ac.jp/javastat/JavaStat-j.htm

13）計算抑制率，公式[（對照-本底）-（給藥-本底）]/（對照-本底）*100%.