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细胞生物学/MTT法测定细胞相对数和相对活力

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MTT法测定细胞相对数和相对活力

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原理

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噻唑兰,简称MTT,可透过细胞膜进入细胞内,活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的Formazan结晶并沉积在细胞中,结晶物能被二甲基亚砜(DMSO)溶解,用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值,可间接反映细胞数量。

试剂材料准备与实验仪器

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1)对数生长期细胞

2)受试因素(药物)

3)MTT:以PBS配制成5mg /ml,抽滤除菌,保存在4˚C

4)DMSO(二甲基亚砜)

5)96孔板

6)酶联免疫检测仪

7)细胞培养箱

实验步骤(适用于贴壁细胞)

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1)收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,分于96孔板,1×104/孔,细胞浓度可以调整。

2)置37℃、5%CO2温箱培养使细胞贴壁。

3)加入不同浓度的药物,如1、5、10、40、50、80、160、320mg/ml的药物,时间依据实验需要,一般3天。

4)小心吸去上清,PBS轻轻洗涤,再次离心,弃上清。

5)每孔加入180 ul新鲜RPMI 1640培养液,再加入20 ul MTT溶液(5 mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4 h。

6)终止培养(可离心,1000 rpm,10 min),小心吸去孔内培养液。

7)每孔加入150 ul二甲基亚砜(也可以用酸化异丙醇,10%SDS代替),置摇床上低速振荡10 min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光值。

8)同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜),每组设定3复孔。

结果统计学处理

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所有数值以x±s表示,应用SPSS软件进行方差分析,p<0.05时为相差显著,p<0.01时为相差非常显著。可以以时间为横轴,光吸收值为纵轴绘制细胞生线,专门公式求IC50。或计算抑制率。

注意事项与常见问题

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1)实验时应设置调零孔,对照孔,加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。 对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜,不同的是对照加溶解药物的介质,而加药组加入不同浓度的药物。

2)每孔中的细胞数可以根据细胞生长的速度调整,并进行预实验调整浓度,太多敏感性降低,太少观察不到差异。

3)贴壁细胞加MTT前吸掉培养液,悬浮细胞可以不吸除培养液,再加入0.5%MTT,量为20ul/孔。

4)如果不使用96孔板,培养基超过100 ml,MTT按照10%的比例加入。

5)MTT一般4度保存两周,注意避光保存,或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存,避免反复冻融,最好小剂量分装,用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解,配制完后可过滤一下。

6)对于DMSO,溶解后呈紫(红)色,490nm有最大吸收值;而对于SDS和酸化异丙醇,则选用570nm,并且建议以655nm作为参考波长。

7)96孔板在培养箱中,由于湿度不够,而培养箱由于具有一定的温度,使得边缘的孔水分蒸发较快,导致培养基中各种成分浓度变化增大,导致细胞状态不同。对于这种现象,要保证培养箱中的湿度,减少开关培养箱的次数和时间。

8)注意细胞悬液一定要混匀,已避免细胞沉淀下来,导致每孔中的细胞数量不等,可以每接几个就要再混匀一下。

9)没有去掉上清直接加DMSO,沉淀会很难溶解。加DMSO前要把液体吸掉,但培养液里的紫色结晶可能会吸去,也可在倒之前先用平板离心机离心96孔板,2000r,5分钟,然后吸掉上清。加入DMSO后可用排枪反复抽吸助溶,溶解后尽快检测。

10)为了减少误差,培养板的四边孔只加培养基或只接种细胞,而不作为指标检测孔。

11)除置摇床上低速振荡10 min,使结晶物充分溶解外,可用枪头吹打,加快溶解,效果亦可;或放入37度放孵箱15分钟溶解结晶。

12)关于如何计算IC50 方法有多种

(1)改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)

(2)Bliss法:自己查阅书籍

(3) IC50计算软件,见下面附件(暂时找不到了)

(4)自己用EXCEL做趋势线来求IC50,关于LD50的方法与此相似!

(5)在线求IC50或EC50:http://chiryo.phar.nagoya-cu.ac.jp/javastat/JavaStat-j.htm

13)计算抑制率,公式[(对照-本底)-(给药-本底)]/(对照-本底)*100%.