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生物化学与分子生物学/生物大分子相互作用研究技术

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常用的分子生物学技术及其应用 - 分子杂交和印迹技术 - PCR技术的原理与应用 - DNA测序技术 - 生物芯片技术 - 蛋白质的分离、纯化与结构分析 - 生物大分子相互作用研究技术
生物大分子之间可相互作用并形成各种复合物,所有的重要生命活动,包括 DNA 的复制、转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等,都是由这些复合物所完成。研究细胞内各种生物大分子的相互作用方式,分析各种蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA复合物的组成和作用方式是理解生命活动基本机制的基础。有关研究技术发展迅速,本节选择性介绍部分方法的原理和用途。

蛋白质相互作用研究技术[编辑]

目前常用的研究蛋白质相互作用的技术包括酵母双杂交、各种亲和分离分析(亲和色谱、免疫共沉淀、标签蛋白沉淀等)、FRET效应分析、噬菌体显示系统筛选等。本部分简要介绍标签蛋白(tagged protein) 沉淀和酵母双杂交技术(yeast two-hybrid system)。

标签蛋白沉淀[编辑]

标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。该方法利用一种带有特定标签(tag) 的纯化融合蛋白作为钓饵,在体外与待检测的纯化蛋白质或含有此待测蛋白质的细胞裂解液温育,然后用可结合蛋白标签的琼脂糖珠将融合蛋白沉淀回收,洗脱液经电泳分离并染色。如果两种蛋白质有直接的结合,待检测蛋白质将与融合蛋白同时被琼脂糖珠沉淀(pull-down), 在电泳胶中见到相应条带。
标签融合蛋白结合实验可用于证明两种蛋白质分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合 的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。该方法亦常用于重组融合蛋白的 纯化。
目前最常用的标签是谷胱甘肽S-转移酶(glutathioneS-transferases, GST) , 有各种商品化的载体用于构建 GST 融合基因,并在大肠杆菌中表达为 GST 融合蛋白。利用 GST 与还原型谷胱甘肽(glutathione, GSH) 的结合作用,可以用共价偶联了 GSH 的琼脂糖珠进行标签蛋白沉淀实验(GST pull-down assay)。另一个常用的易于用常规亲和色谱方法纯化的标签分子是可以与锦离子琼脂糖珠结合的6个连续排列组氨酸(6×His) 标签。

酵母双杂交技术[编辑]

酵母双杂交系统目前已经成为分析细胞内未知蛋白质相互作用的主要手段之一。该技术的建立是基于对酵母转录激活因子 GAIA 分子的认识。GAIA 分子的 DNA 结合区 (binding domain, BD) 和促进转录的活性区(activation domain, AD)被分开后将丧失对下游基因表达的激活作用,但是如果 BD 和 AD 分别融合了具有配对相互作用的两种蛋白质分子后,就可以依靠所融合的蛋白质分子之间的相互作用而恢复对下游基因的表达激活作用。
酵母双杂交系统可以用于:①证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用;②分析已知存在相 互作用的两种蛋白质分子的相互作用功能结构域或关键氨基酸残基;③将待研究蛋白质的编码基因与 BD 基因融合成为“诱饵”表达质粒,可以筛选 AD 基因融合的“猎物”基因的 cDNA 表达文库,获得未知的相互作用蛋白质。

DNA-蛋白质相互作用分析技术[编辑]

蛋白质与 DNA 相互作用是基因表达及其调控的基本机制。分析各种转录因子所结合的特定 DNA 序列及基因的调控序列所结合的蛋白质是阐明基因表达调控机制的主要研究内容。这里介绍两种目前常用的研究 DNA 与蛋白质相互作用的技术。

电泳迁移率变动分析[编辑]

电泳迁移率变动分析(electrophoretic mobility shift assay, EMSA) 或称凝胶迁移变动分析(gel shift assay)最初用于研究 DNA 结合蛋白与相应 DNA 序列间的相互作用,可用于定性和定量分析,已经成为转录因子研究的经典方法。目前这一技术也被用于研究 RNA 结合蛋白和特定 RNA 序列间的相互作用。
DNA 结合蛋白与特定 DNA 探针片段的结合会增大其分子量,在凝胶中的电泳速度慢于游离探针,即表现为条带相对滞后。在实验中预先用放射性核素或生物素标记待检测的 DNA 探针,再将标记好的探针与细胞核提取物温育一定时间,使其形成 DNA-蛋白质复合物,然后将温育后的反应液进行非变性(不加SDS, 以免形成的复合物解离)聚丙烯凝胶酰胺电泳,最后用放射自显影等技术显示出标记 DNA 探针的条带位置。

染色质免疫沉淀技术[编辑]

真核生物的基因组 DNA 以染色质的形式存在。因此,研究蛋白质与 DNA 在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的重要途径。染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)是目前可以研究体内DNA与蛋白质相互作用的主要方法。它的基本原理是在活细胞状态下,用化学交联试剂固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,再利用PCR技术特异性地富集目的蛋白质结合的DNA片段,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
近年来,人们将 ChIP 和芯片技术结合在一起,建立了 ChIP 芯片 (ChIP-1ip)技术。该方法是在全基因组范围筛选与特定蛋白质相结合的 DNA 序列,即鉴定特定核蛋白的 DNA 结合靶点的一项新 技术。