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生物化学与分子生物学/DNA测序技术

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常用的分子生物学技术及其应用 - 分子杂交和印迹技术 - PCR技术的原理与应用 - DNA测序技术 - 生物芯片技术 - 蛋白质的分离、纯化与结构分析 - 生物大分子相互作用研究技术
DNA测序(DNA sequencing)的目的是确定一段DNA分子中4种碱基(A、G、C、T)的排列顺序。DNA测序技术是阐明和理解基因结构、基因功能、基因变异、基因表达调控的基础,也是实现在分子层次预测、预防、诊断和治疗疾病的个体化医学的最重要的支撑技术。
分子生物学发展的初期,采用部分酶解等方法仅能测定RNA的序列,且费时费力。1977年, Maxam AM和 Gilbert W合作创立了化学降解法,又称 Maxam-Gilbert测序法;同年,Sanger F创建了双脱氧测序法或称Sanger法。这两种方法的建立实现了DNA测序技术的第一次飞跃,三位科学家也因此分享了1980年的诺贝尔化学奖。40余年来,DNA测序技术发展迅速,从手工操作到自动化仪器分析、从单一短片段到高通量平行分析,尤其是在人类 基因组计划的推进和带动下,已经实现了高速和低价的目标,人全基因组30亿碱基对的测序目前已经成为常规技术。快速测序技术极大推动了生物学和医学多个领域的理论突破和应用研究。

双脱氧法和化学降解法是经典DNA测序方法[编辑]

早期的DNA测序只能在实验室内手工完成,故基本上是用于分子生物学研究工作,采用的是双脱氧法或化学降解法。

双脱氧法DNA测序技术[编辑]

Sanger 双脱氧测序(dideoxy sequencing)法亦称为链终止(chain-termination method)法,基于对引物的延伸合成反应。用DNA聚合酶来延伸结合在待测序列 DNA 模板上的寡脱氧核苷酸引物,直到在新合成的DNA 链的 3'-末端掺入了4种放射性核素标记的2',3'-双脱氧核苷三磷酸(ddNTP) 底物的其中一种。由于ddNTP 脱氧核糖的 3'-位碳原子上缺少羟基而不能与下一位核苷酸的5'-位磷酸基之间形成 3',5'-磷酸二酯键,从而使得正在延伸的DNA链在该 ddNTP 处终止。因此,在 4 种不同反应体系中分别加入 4 种不同的 ddNTP 底物(A、G、C、T),就可得到终止于相应特定碱基的一系列不同长度DNA片段。这些片段具有共同的起点,而有不同的终点(即ddNTP掺入的位置),其长度取决于 ddNTP 掺入的位置与引物 5'-末端之间的距离。经可分辨 1 个核苷酸差别的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离这些片段,再借助片段的放射性核素或荧光标记,即可读出一段DNA序列。

化学降解法DNA测序技术[编辑]

Maxam-Gilbert 化学降解测序(chemical degradation sequencing) 法则首先对待测序的DNA 片段的末端进行放射性核素标记,然后用专一性化学试剂将该片段 DNA 进行特异性降解,从而产生 4 套含有长短不一DNA片段的混合物,再通过其所带的标记读出序列。这一方法的建立在分子生物学发展早期发挥了重要作用,但因其费用高且难以实现自动化而被其他方法取代。

第一代全自动激光荧光DNA测序仪器基于双脱氧法[编辑]

Sanger方法和Maxam-Gilbert化学降解法的手工操作对技术人员的经验和技术熟练程度要求很高,实验失败概率高,难以在普通实验室推广普及,更难以满足分子生物学的迅速发展及其在医学等领域应用的需求,因而催生了自动化分析仪的发明。
早期的全自动DNA序列分析仪的工作原理主要是基于Sanger法,采用四色荧光标记 ddNTP而制作的。目前,自动激光荧光DNA测序仪(又称第一代测序仪)的应用已十分普遍,它可实现制胶、进样、电泳、检测、数据分析全自动化。第一代测序技术的读长可以超过lOOObp,原始数据的准确率可高达99.999%。
在四色荧光法分析中,采用4种不同荧光染料标记4种不同的可终止DNA延伸反应的底物 ddNTP, 经Sanger法反应后,赋予所合成的DNA片段4种不同的颜色。待测DNA样品的4个反应产物在同一个泳道内依照片段大小电泳分离,由仪器自动连续采集荧光数据并完成分析,最后直接显示待测DNA的碱基序列。
人类基因组计划的第一个人类基因组草图的绘制采用的就是Sanger法。美国、英国、日本、法国、德国、加拿大、中国等7个国家的科学家合作,用了众多自动激光荧光DNA测序仪,以集成式工厂化运行模式而完成的。

高通量DNA测序技术使基因测序走向医学实用[编辑]

要将人类基因组序列分析的研究成果用于各种复杂疾病的机制研究、诊断、预警、治疗监测以及 法医学鉴定等医学实践,需要对入群及个体进行全基因组序列分析。为此必须首先实现DNA测序技 术的微量、快速和低成本化,而标准的Sanger法及第一代测序仪的高成本很难满足这一需求,新的高通量DNA测序技术及其分析仪器因此应运而生。这些新技术被冠以新一代测序(next generation sequencing, NGS)之称,并先后有第二代、第三代甚至第四代之分,其共同特点都是实现了微量化、高通量并行化和低成本。
所有的 NGS都是在一次反应中同时分析多个DNA小片段,因而可快速获得所有序列,再经生物信息学整合分析,得出个体的基因组序列。在超高通量测序时,甚至可并行百万个测序反应。需要指出的是,每一种新的高通量测序技术都是伴随相应的新仪器而诞生的,否则无法进入生物学和医学领域。
一些 NGS 技术需要首先进行待测DNA片段的PCR扩增。这些技术和仪器主要包括:①454基因组测序仪利用焦磷酸测序,检测DNA合成产生的焦磷酸。综合运用了乳液PCR、微流控芯片、焦磷酸检测等技术。②Solexa/Illumina 测序仪检测DNA合成反应中掺入的荧光标记单核苷酸,利用桥式PCR、微流控芯片、荧光标记基团和终止基团检测等技术。③SOLiD测序仪基于寡核苷酸连接反应,利用乳液PCR、微流控芯片,检测DNA连接酶催化的荧光标记寡核昔酸探针连接到DNA链过程中释放出的光学信号。
更新一代的测序技术则无需PCR扩增反应,直接针对DNA单分子进行序列分析,亦称为第三代测序技术。这些技术包括HeliScope 测序技术、单分子实时技术(single molecule real time technology, SMRT)以及基于荧光共振能量转移(FRET)的测序技术等区。
高通量DNA测序技术的快速进步极大促进了人全基因组测序(wholegenome sequencing, WGS)、转录组测序(RNA-seq)、全外显子测序(Exome-seq)、DNA-蛋白质相互作用,即染色质免疫共沉淀测序(ChIP-seq)、病原微生物全基因组测序等在医学研究和实践中的应用,为医学进入大数据时代提供了核心技术支撑。

DNA测序在医学领域具有广泛应用价值[编辑]

DNA测序技术在医学领域的使用日益广泛和深入。DNA测序在医学研究和临床实践中的主要用途是:①通过人群大样本分析,确定单基因遗传病和多基因变异相关疾病的SNP位点、基因结构变异、基因拷贝数变异等,鉴定出可用于复杂性疾病易感性预警或早期诊断的疾病标志物,并将这些单一基因或多个基因的变异检测用千临床诊断。这些变异的发现还将指导治疗靶点的确认和药物研发;②检测肿瘤组织的染色体畸变癌基因和抑癌基因突变位点、融合基因、染色体拷贝数变化等,为 肿瘤分子分型和治疗敏感性监测提供依据;③进行个人基因组分析,在大数据平台发展的基础上,建立个人 SNP 位点与疾病易感性、药物敏感性和耐受性以及其他诸多表型之间的联系;④用于病原微生物检测,确定病原微生物的分子分型,为抗病毒或细菌感染治疗提供依据。
DNA测序在法医学领域具有特殊意义。该技术极大提高了 DNA 鉴定的敏感性和准确性,在各类案件中作为司法证据的重要性越加凸显。DNA测序在亲子鉴定中亦具有重要价值。