生物化學與分子生物學/生物大分子相互作用研究技術
常用的分子生物學技術及其應用 -
分子雜交和印跡技術 -
PCR技術的原理與應用 -
DNA測序技術 -
生物晶片技術 -
蛋白質的分離、純化與結構分析 -
生物大分子相互作用研究技術
生物大分子之間可相互作用並形成各種複合物，所有的重要生命活動，包括 DNA 的複製、轉錄、蛋白質的合成與分泌、信號轉導和代謝等，都是由這些複合物所完成。研究細胞內各種生物大分子的相互作用方式，分析各種蛋白質、蛋白質-DNA、蛋白質-RNA複合物的組成和作用方式是理解生命活動基本機制的基礎。有關研究技術發展迅速，本節選擇性介紹部分方法的原理和用途。
蛋白質相互作用研究技術
[編輯]目前常用的研究蛋白質相互作用的技術包括酵母雙雜交、各種親和分離分析（親和色譜、免疫共沉澱、標籤蛋白沉澱等）、FRET效應分析、噬菌體顯示系統篩選等。本部分簡要介紹標籤蛋白(tagged protein) 沉澱和酵母雙雜交技術(yeast two-hybrid system)。
標籤蛋白沉澱
[編輯]標籤融合蛋白結合實驗是一個基於親和色譜原理的、分析蛋白質體外直接相互作用的方法。該方法利用一種帶有特定標籤(tag) 的純化融合蛋白作為釣餌，在體外與待檢測的純化蛋白質或含有此待測蛋白質的細胞裂解液溫育，然後用可結合蛋白標籤的瓊脂糖珠將融合蛋白沉澱回收，洗脫液經電泳分離並染色。如果兩種蛋白質有直接的結合，待檢測蛋白質將與融合蛋白同時被瓊脂糖珠沉澱(pull-down), 在電泳膠中見到相應條帶。
標籤融合蛋白結合實驗可用於證明兩種蛋白質分子是否存在直接物理結合、分析兩種分子結合 的具體結構部位及篩選細胞內與融合蛋白相結合的未知分子。該方法亦常用於重組融合蛋白的 純化。
目前最常用的標籤是穀胱甘肽S-轉移酶(glutathioneS-transferases, GST) , 有各種商品化的載體用於構建 GST 融合基因，並在大腸桿菌中表達為 GST 融合蛋白。利用 GST 與還原型穀胱甘肽(glutathione, GSH) 的結合作用，可以用共價偶聯了 GSH 的瓊脂糖珠進行標籤蛋白沉澱實驗(GST pull-down assay)。另一個常用的易於用常規親和色譜方法純化的標籤分子是可以與錦離子瓊脂糖珠結合的6個連續排列組氨酸(6×His) 標籤。
酵母雙雜交技術
[編輯]酵母雙雜交系統目前已經成為分析細胞內未知蛋白質相互作用的主要手段之一。該技術的建立是基於對酵母轉錄激活因子 GAIA 分子的認識。GAIA 分子的 DNA 結合區 (binding domain, BD) 和促進轉錄的活性區(activation domain, AD)被分開後將喪失對下游基因表達的激活作用，但是如果 BD 和 AD 分別融合了具有配對相互作用的兩種蛋白質分子後，就可以依靠所融合的蛋白質分子之間的相互作用而恢復對下游基因的表達激活作用。
酵母雙雜交系統可以用於：①證明兩種已知基因序列的蛋白質可以相互作用；②分析已知存在相
互作用的兩種蛋白質分子的相互作用功能結構域或關鍵胺基酸殘基；③將待研究蛋白質的編碼基因與 BD 基因融合成為「誘餌」表達質體，可以篩選 AD 基因融合的「獵物」基因的 cDNA 表達文庫，獲得未知的相互作用蛋白質。
DNA-蛋白質相互作用分析技術
[編輯]蛋白質與 DNA 相互作用是基因表達及其調控的基本機制。分析各種轉錄因子所結合的特定 DNA 序列及基因的調控序列所結合的蛋白質是闡明基因表達調控機制的主要研究內容。這裡介紹兩種目前常用的研究 DNA 與蛋白質相互作用的技術。
電泳遷移率變動分析
[編輯]電泳遷移率變動分析(electrophoretic mobility shift assay, EMSA) 或稱凝膠遷移變動分析(gel shift assay)最初用於研究 DNA 結合蛋白與相應 DNA 序列間的相互作用，可用於定性和定量分析，已經成為轉錄因子研究的經典方法。目前這一技術也被用於研究 RNA 結合蛋白和特定 RNA 序列間的相互作用。
DNA 結合蛋白與特定 DNA 探針片段的結合會增大其分子量，在凝膠中的電泳速度慢於游離探針，即表現為條帶相對滯後。在實驗中預先用放射性核素或生物素標記待檢測的 DNA 探針，再將標記好的探針與細胞核提取物溫育一定時間，使其形成 DNA-蛋白質複合物，然後將溫育後的反應液進行非變性（不加SDS, 以免形成的複合物解離）聚丙烯凝膠醯胺電泳，最後用放射自顯影等技術顯示出標記 DNA 探針的條帶位置。
染色質免疫沉澱技術
[編輯]真核生物的基因組 DNA 以染色質的形式存在。因此，研究蛋白質與 DNA 在染色質環境下的相互作用是闡明真核生物基因表達機制的重要途徑。染色質免疫沉澱技術(chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)是目前可以研究體內DNA與蛋白質相互作用的主要方法。它的基本原理是在活細胞狀態下，用化學交聯試劑固定蛋白質-DNA複合物，並將其隨機切斷為一定長度範圍內的染色質小片段，然後通過免疫學方法沉澱此複合體，再利用PCR技術特異性地富集目的蛋白質結合的DNA片段，從而獲得蛋白質與DNA相互作用的信息。
近年來，人們將 ChIP 和晶片技術結合在一起，建立了 ChIP 晶片 (ChIP-1ip)技術。該方法是在全基因組範圍篩選與特定蛋白質相結合的 DNA 序列，即鑑定特定核蛋白的 DNA 結合靶點的一項新 技術。