生物化学与分子生物学/DNA实验技术/动物基因组DNA的提取

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实验原理[编辑]

在EDTA和SDS等去污剂存在下,用蛋白酶K消化细胞,随后用酚抽提,可以得到哺乳动构基因组DNA,用此方法得到的DNA长度为100-150 kb,适用于L嘴菌体构建基因组文库和 Southern分析。

通过本实验了解并掌握提取基因组DNA的原理和步骤,以及相对分子质量较大的DNA的琼脂糖凝胶电泳技术。

仪器、材料与试剂[编辑]

仪器[编辑]

  1. 台式离心机
  2. 玻璃匀浆器
  3. 高压灭菌锅
  4. 恒温水浴

材料[编辑]

  1. 1.5mL微量离心管
  2. 微量取样器和吸头
  3. 无菌过滤器(一次性)
  4. 10 mL注射器
  5. 鼠肝
  6. 三羟甲基氨基甲烷(Tris)
  7. 十二烷基硫酸钠(SDS)
  8. 乙二胺四乙酸(EDTA)
  9. 蛋白酶K
  10. RNA酶
  11. DNA相对分子质量标准物,DNA/EcoRI+HindⅢ相对分子质量标准物

试剂[编辑]

1.5 mol/L NaCl
0.5 mol/L Tris·HCI pH8.0
0.5 mol/L EDTA pH8.0
3 mol/L NaAc pH5.2
以上均高压灭菌。
蛋白酶K 10mg/mL配好后用一次性过滤器过滤,-20℃保存
组织匀浆液 100mmol/LNaCI,10mmol/LTris·HCl(pH 8.0),0.25mmol/LEDTA(pH8.0)
酶解液 200mmol/LNaCI,20mmol/L Tris·HCI(pH 8.O),50mmol/LEDTA(PH 8.0),200~g/mL蛋白酶K,1%SDS
无DNA酵的RNA酶 将胰RNA酶溶解于10mmol/L Tris.HCI(pH7.5)、15 mmol/L  NaCl溶液中,浓度l0mg/mL,于100℃水浴处理15min,以降解DNA酶,缓慢冷却到室温,-20℃保存
TE缓冲液 10mmol/LTris·HCl(pH8.0),25 mmol/LEDTA(pH8.0)
平衡酚(pH8.0):氧仿:异戊醇=25:24:1 (体积比) 氧仿,异戊醇=24:1 (体积比)
5xTBE 5.4gTris,2.75g硼酸  2mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0),加水到100mL;
6x上样缓冲液 0.25%溴酚蓝,40%(W/V)蔗糖水溶液
λDNA/EcoRI+/HindⅢ 相对分于质量标准物片段(bP) 21 227,5148,4 973,4 268,3 530,2 027,1 904,1 584,1 315,947,831,564,125

实验步骤[编辑]

本实验在无液氮的条件下,铡备鼠肝DNA,与有液氮条件下相比,产量和质量都有所下降。整个操作过程中,应尽量避免DNA酶的污染,特g4注童动作温和,减少对DNA的机械捌伤。

  1. 取0.2g鼠肝,用冰冷的生理盐水洗3次,然后置于2.0mL匀浆掖中,用玻璃匀浆器匀浆至无明显组织块存在(冰浴操作,切匆将细胞破碎,可镜检观察)。
  2. 将组织细胞移至1.5ml离心管中,50000rpm离心30-60sec,(尽可能在低温下操作),弃上清,若沉淀中血细胞较多,可再加入1倍于细胞体积的匀浆液洗一次。
  3. 沉淀加0.8mL无菌水迅速吹散,分两管,再加0.4mL酵解液,翻转混匀(动作一定要轻)55℃水浴处理12-18 h;
  4. 沉淀加RNase至终浓度200µg/mL,37℃水浴1 h;
  5. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇抽提一次,(慢慢旋转混勾,倾斜使两相接触面增大)。4℃、10min、10000rpm离心;
  6. 有时如果DNA含量过高,水相在下层,实验时应注意观察。用扩口吸头移出含DNA的水相(注意勿吸出界面中蛋白沉淀),加等体积氧仿/异戊醇,4℃、
  7. 10 000rrpm离心10rain (若界面或水相中蛋白含量多,可重复1.6操作)。
  8. 用扩口吸头小心吸出上层含DNA的水相,加1/10体积的NaAc,小心混匀(要充分),再向每管中加入2.5倍体积的无水乙醇,-20  过夜。
  9. 12 000rpm离心19min,弃上清,75%冷乙醇洗涤一次,12000rpm离心15min室握温干燥(不要大干,否则DNA不易溶解),加入适量TE缓冲液,存放于4℃,轻摇溶解过夜,即可得 到实验动物基因组DNA。
  10. 电泳鉴定DNA,由于基因组DNA相对分子质量较大,用0.3%的琼脂糖凝胶电泳鉴定,先在底部锦一层1%的支持胶,凝固后再铺上一层0.3%琼脂糖凝胶,插上梳子(枚子不能瑾到的支持胶)。取1.5µL溶解的DNA、1µL上样缓冲液和35µl无菌水混匀后小心上样(可在另一孔加DNA相对分于质量标准),观察基因组DNA大小,用溴化乙锭染色观察结果。

注意事项[编辑]

  1. 操作过程尽量在低温下进行,避免DNA降解。
  2. 琼脂糖凝胶脆弱,应小心操作。
  3. 提取得到的基因组DNA应为单一条带,DNA降解可形成弥散带型。