生物化學與分子生物學/DNA實驗技術/動物基因組DNA的提取

維基教科書,自由的教學讀本
跳至導覽 跳至搜尋

實驗原理[編輯]

在EDTA和SDS等去污劑存在下,用蛋白酶K消化細胞,隨後用酚抽提,可以得到哺乳動構基因組DNA,用此方法得到的DNA長度為100-150 kb,適用於L嘴菌體構建基因組文庫和 Southern分析。

通過本實驗了解並掌握提取基因組DNA的原理和步驟,以及相對分子質量較大的DNA的瓊脂糖凝膠電泳技術。

儀器、材料與試劑[編輯]

儀器[編輯]

  1. 台式離心機
  2. 玻璃勻漿器
  3. 高壓滅菌鍋
  4. 恆溫水浴

材料[編輯]

  1. 1.5mL微量離心管
  2. 微量取樣器和吸頭
  3. 無菌過濾器(一次性)
  4. 10 mL注射器
  5. 鼠肝
  6. 三羥甲基氨基甲烷(Tris)
  7. 十二烷基硫酸鈉(SDS)
  8. 乙二胺四乙酸(EDTA)
  9. 蛋白酶K
  10. RNA酶
  11. DNA相對分子質量標準物,DNA/EcoRI+HindⅢ相對分子質量標準物

試劑[編輯]

1.5 mol/L NaCl
0.5 mol/L Tris·HCI pH8.0
0.5 mol/L EDTA pH8.0
3 mol/L NaAc pH5.2
以上均高壓滅菌。
蛋白酶K 10mg/mL配好後用一次性過濾器過濾,-20℃保存
組織勻漿液 100mmol/LNaCI,10mmol/LTris·HCl(pH 8.0),0.25mmol/LEDTA(pH8.0)
酶解液 200mmol/LNaCI,20mmol/L Tris·HCI(pH 8.O),50mmol/LEDTA(PH 8.0),200~g/mL蛋白酶K,1%SDS
無DNA酵的RNA酶 將胰RNA酶溶解於10mmol/L Tris.HCI(pH7.5)、15 mmol/L  NaCl溶液中,濃度l0mg/mL,於100℃水浴處理15min,以降解DNA酶,緩慢冷卻到室溫,-20℃保存
TE緩衝液 10mmol/LTris·HCl(pH8.0),25 mmol/LEDTA(pH8.0)
平衡酚(pH8.0):氧仿:異戊醇=25:24:1 (體積比) 氧仿,異戊醇=24:1 (體積比)
5xTBE 5.4gTris,2.75g硼酸  2mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0),加水到100mL;
6x上樣緩衝液 0.25%溴酚藍,40%(W/V)蔗糖水溶液
λDNA/EcoRI+/HindⅢ 相對分於質量標準物片段(bP) 21 227,5148,4 973,4 268,3 530,2 027,1 904,1 584,1 315,947,831,564,125

實驗步驟[編輯]

本實驗在無液氮的條件下,鍘備鼠肝DNA,與有液氮條件下相比,產量和質量都有所下降。整個操作過程中,應儘量避免DNA酶的污染,特g4注童動作溫和,減少對DNA的機械捌傷。

  1. 取0.2g鼠肝,用冰冷的生理鹽水洗3次,然後置於2.0mL勻漿掖中,用玻璃勻漿器勻漿至無明顯組織塊存在(冰浴操作,切匆將細胞破碎,可鏡檢觀察)。
  2. 將組織細胞移至1.5ml離心管中,50000rpm離心30-60sec,(儘可能在低溫下操作),棄上清,若沉澱中血細胞較多,可再加入1倍於細胞體積的勻漿液洗一次。
  3. 沉澱加0.8mL無菌水迅速吹散,分兩管,再加0.4mL酵解液,翻轉混勻(動作一定要輕)55℃水浴處理12-18 h;
  4. 沉澱加RNase至終濃度200µg/mL,37℃水浴1 h;
  5. 加入等體積酚/氯仿/異戊醇抽提一次,(慢慢旋轉混勾,傾斜使兩相接觸面增大)。4℃、10min、10000rpm離心;
  6. 有時如果DNA含量過高,水相在下層,實驗時應注意觀察。用擴口吸頭移出含DNA的水相(注意勿吸出界面中蛋白沉澱),加等體積氧仿/異戊醇,4℃、
  7. 10 000rrpm離心10rain (若界面或水相中蛋白含量多,可重複1.6操作)。
  8. 用擴口吸頭小心吸出上層含DNA的水相,加1/10體積的NaAc,小心混勻(要充分),再向每管中加入2.5倍體積的無水乙醇,-20  過夜。
  9. 12 000rpm離心19min,棄上清,75%冷乙醇洗滌一次,12000rpm離心15min室握溫乾燥(不要大干,否則DNA不易溶解),加入適量TE緩衝液,存放於4℃,輕搖溶解過夜,即可得 到實驗動物基因組DNA。
  10. 電泳鑑定DNA,由於基因組DNA相對分子質量較大,用0.3%的瓊脂糖凝膠電泳鑑定,先在底部錦一層1%的支持膠,凝固後再鋪上一層0.3%瓊脂糖凝膠,插上梳子(枚子不能瑾到的支持膠)。取1.5µL溶解的DNA、1µL上樣緩衝液和35µl無菌水混勻後小心上樣(可在另一孔加DNA相對分於質量標準),觀察基因組DNA大小,用溴化乙錠染色觀察結果。

注意事項[編輯]

  1. 操作過程儘量在低溫下進行,避免DNA降解。
  2. 瓊脂糖凝膠脆弱,應小心操作。
  3. 提取得到的基因組DNA應為單一條帶,DNA降解可形成彌散帶型。