生物化學與分子生物學/DNA實驗技術/動物基因組DNA的提取

實驗原理[編輯]

在EDTA和SDS等去污劑存在下，用蛋白酶K消化細胞，隨後用酚抽提，可以得到哺乳動構基因組DNA，用此方法得到的DNA長度為100-150 kb，適用於L嘴菌體構建基因組文庫和 Southern分析。

通過本實驗了解並掌握提取基因組DNA的原理和步驟，以及相對分子質量較大的DNA的瓊脂糖凝膠電泳技術。

儀器、材料與試劑[編輯]

儀器[編輯]

台式離心機
玻璃勻漿器
高壓滅菌鍋
恆溫水浴

材料[編輯]

1.5mL微量離心管
微量取樣器和吸頭
無菌過濾器(一次性)
10 mL注射器
鼠肝
三羥甲基氨基甲烷(Tris)
十二烷基硫酸鈉(SDS)
乙二胺四乙酸(EDTA)
蛋白酶K
RNA酶
DNA相對分子質量標準物，DNA／EcoRI+HindⅢ相對分子質量標準物

試劑[編輯]

1.5 mol／L NaCl
0.5 mol／L Tris·HCI pH8.0
0.5 mol／L EDTA pH8.0
3 mol／L NaAc pH5.2
以上均高壓滅菌。
蛋白酶K	10mg／mL配好後用一次性過濾器過濾，-20℃保存
組織勻漿液	100mmol／LNaCI，10mmol／LTris·HCl(pH 8.0)，0.25mmol／LEDTA(pH8.0)
酶解液	200mmol／LNaCI，20mmol／L Tris·HCI(pH 8．O)，50mmol／LEDTA(PH 8.0)，200~g／mL蛋白酶K，1％SDS
無DNA酵的RNA酶	將胰RNA酶溶解於10mmol／L Tris.HCI(pH7.5)、15 mmol／L NaCl溶液中，濃度l0mg／mL，於100℃水浴處理15min，以降解DNA酶，緩慢冷卻到室溫，-20℃保存
TE緩衝液	10mmol／LTris·HCl(pH8.0)，25 mmol／LEDTA(pH8.0)
平衡酚(pH8.0)：氧仿：異戊醇=25:24:1 (體積比)	氧仿，異戊醇=24:1 (體積比)
5xTBE	5.4gTris，2.75g硼酸 2mL 0.5mol／L EDTA(pH8.0)，加水到100mL；
6x上樣緩衝液	0.25％溴酚藍，40％(W／V)蔗糖水溶液
λDNA／EcoRI+／HindⅢ 相對分於質量標準物片段(bP)	21 227，5148，4 973，4 268，3 530，2 027，1 904，1 584，1 315，947，831，564，125

實驗步驟[編輯]

本實驗在無液氮的條件下，鍘備鼠肝DNA，與有液氮條件下相比，產量和質量都有所下降。整個操作過程中，應儘量避免DNA酶的污染，特g4注童動作溫和，減少對DNA的機械捌傷。

取0.2g鼠肝，用冰冷的生理鹽水洗3次，然後置於2.0mL勻漿掖中，用玻璃勻漿器勻漿至無明顯組織塊存在(冰浴操作，切匆將細胞破碎，可鏡檢觀察)。
將組織細胞移至1.5ml離心管中，50000rpm離心30-60sec，(儘可能在低溫下操作)，棄上清，若沉澱中血細胞較多，可再加入1倍於細胞體積的勻漿液洗一次。
沉澱加0.8mL無菌水迅速吹散，分兩管，再加0.4mL酵解液，翻轉混勻(動作一定要輕)55℃水浴處理12-18 h；
沉澱加RNase至終濃度200µg／mL，37℃水浴1 h；
加入等體積酚／氯仿／異戊醇抽提一次，(慢慢旋轉混勾，傾斜使兩相接觸面增大)。4℃、10min、10000rpm離心；
有時如果DNA含量過高，水相在下層，實驗時應注意觀察。用擴口吸頭移出含DNA的水相(注意勿吸出界面中蛋白沉澱)，加等體積氧仿／異戊醇，4℃、
10 000rrpm離心10rain (若界面或水相中蛋白含量多，可重複1．6操作)。
用擴口吸頭小心吸出上層含DNA的水相，加1／10體積的NaAc，小心混勻(要充分)，再向每管中加入2.5倍體積的無水乙醇，-20 過夜。
12 000rpm離心19min，棄上清，75％冷乙醇洗滌一次，12000rpm離心15min室握溫乾燥(不要大干，否則DNA不易溶解)，加入適量TE緩衝液，存放於4℃，輕搖溶解過夜，即可得到實驗動物基因組DNA。
電泳鑑定DNA，由於基因組DNA相對分子質量較大，用0.3％的瓊脂糖凝膠電泳鑑定，先在底部錦一層1％的支持膠，凝固後再鋪上一層0.3％瓊脂糖凝膠，插上梳子(枚子不能瑾到的支持膠)。取1.5µL溶解的DNA、1µL上樣緩衝液和35µl無菌水混勻後小心上樣(可在另一孔加DNA相對分於質量標準)，觀察基因組DNA大小，用溴化乙錠染色觀察結果。

注意事項[編輯]

操作過程儘量在低溫下進行，避免DNA降解。
瓊脂糖凝膠脆弱，應小心操作。
提取得到的基因組DNA應為單一條帶，DNA降解可形成彌散帶型。