生物化學與分子生物學/DNA測序技術

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常用的分子生物學技術及其應用 - 分子雜交和印跡技術 - PCR技術的原理與應用 - DNA測序技術 - 生物芯片技術 - 蛋白質的分離、純化與結構分析 - 生物大分子相互作用研究技術
DNA測序(DNA sequencing)的目的是確定一段DNA分子中4種鹼基(A、G、C、T)的排列順序。DNA測序技術是闡明和理解基因結構、基因功能、基因變異、基因表達調控的基礎,也是實現在分子層次預測、預防、診斷和治療疾病的個體化醫學的最重要的支撐技術。
分子生物學發展的初期,採用部分酶解等方法僅能測定RNA的序列,且費時費力。1977年, Maxam AM和 Gilbert W合作創立了化學降解法,又稱 Maxam-Gilbert測序法;同年,Sanger F創建了雙脫氧測序法或稱Sanger法。這兩種方法的建立實現了DNA測序技術的第一次飛躍,三位科學家也因此分享了1980年的諾貝爾化學獎。40餘年來,DNA測序技術發展迅速,從手工操作到自動化儀器分析、從單一短片段到高通量平行分析,尤其是在人類 基因組計劃的推進和帶動下,已經實現了高速和低價的目標,人全基因組30億鹼基對的測序目前已經成為常規技術。快速測序技術極大推動了生物學和醫學多個領域的理論突破和應用研究。

雙脫氧法和化學降解法是經典DNA測序方法[編輯]

早期的DNA測序只能在實驗室內手工完成,故基本上是用於分子生物學研究工作,採用的是雙脫氧法或化學降解法。

雙脫氧法DNA測序技術[編輯]

Sanger 雙脫氧測序(dideoxy sequencing)法亦稱為鏈終止(chain-termination method)法,基於對引物的延伸合成反應。用DNA聚合酶來延伸結合在待測序列 DNA 模板上的寡脫氧核苷酸引物,直到在新合成的DNA 鏈的 3'-末端摻入了4种放射性核素標記的2',3'-雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP) 底物的其中一種。由於ddNTP 脫氧核糖的 3'-位碳原子上缺少羥基而不能與下一位核苷酸的5'-位磷酸基之間形成 3',5'-磷酸二酯鍵,從而使得正在延伸的DNA鏈在該 ddNTP 處終止。因此,在 4 種不同反應體系中分別加入 4 種不同的 ddNTP 底物(A、G、C、T),就可得到終止於相應特定鹼基的一系列不同長度DNA片段。這些片段具有共同的起點,而有不同的終點(即ddNTP摻入的位置),其長度取決於 ddNTP 摻入的位置與引物 5'-末端之間的距離。經可分辨 1 個核苷酸差別的變性聚丙烯醯胺凝膠電泳分離這些片段,再藉助片段的放射性核素或熒光標記,即可讀出一段DNA序列。

化學降解法DNA測序技術[編輯]

Maxam-Gilbert 化學降解測序(chemical degradation sequencing) 法則首先對待測序的DNA 片段的末端進行放射性核素標記,然後用專一性化學試劑將該片段 DNA 進行特異性降解,從而產生 4 套含有長短不一DNA片段的混合物,再通過其所帶的標記讀出序列。這一方法的建立在分子生物學發展早期發揮了重要作用,但因其費用高且難以實現自動化而被其他方法取代。

第一代全自動激光熒光DNA測序儀器基於雙脫氧法[編輯]

Sanger方法和Maxam-Gilbert化學降解法的手工操作對技術人員的經驗和技術熟練程度要求很高,實驗失敗概率高,難以在普通實驗室推廣普及,更難以滿足分子生物學的迅速發展及其在醫學等領域應用的需求,因而催生了自動化分析儀的發明。
早期的全自動DNA序列分析儀的工作原理主要是基於Sanger法,採用四色熒光標記 ddNTP而製作的。目前,自動激光熒光DNA測序儀(又稱第一代測序儀)的應用已十分普遍,它可實現制膠、進樣、電泳、檢測、數據分析全自動化。第一代測序技術的讀長可以超過lOOObp,原始數據的準確率可高達99.999%。
在四色熒光法分析中,採用4種不同熒光染料標記4種不同的可終止DNA延伸反應的底物 ddNTP, 經Sanger法反應後,賦予所合成的DNA片段4種不同的顏色。待測DNA樣品的4個反應產物在同一個泳道內依照片段大小電泳分離,由儀器自動連續採集熒光數據並完成分析,最後直接顯示待測DNA的鹼基序列。
人類基因組計劃的第一個人類基因組草圖的繪製採用的就是Sanger法。美國、英國、日本、法國、德國、加拿大、中國等7個國家的科學家合作,用了眾多自動激光熒光DNA測序儀,以集成式工廠化運行模式而完成的。

高通量DNA測序技術使基因測序走向醫學實用[編輯]

要將人類基因組序列分析的研究成果用於各種複雜疾病的機制研究、診斷、預警、治療監測以及 法醫學鑑定等醫學實踐,需要對入群及個體進行全基因組序列分析。為此必須首先實現DNA測序技 術的微量、快速和低成本化,而標準的Sanger法及第一代測序儀的高成本很難滿足這一需求,新的高通量DNA測序技術及其分析儀器因此應運而生。這些新技術被冠以新一代測序(next generation sequencing, NGS)之稱,並先後有第二代、第三代甚至第四代之分,其共同特點都是實現了微量化、高通量並行化和低成本。
所有的 NGS都是在一次反應中同時分析多個DNA小片段,因而可快速獲得所有序列,再經生物信息學整合分析,得出個體的基因組序列。在超高通量測序時,甚至可並行百萬個測序反應。需要指出的是,每一種新的高通量測序技術都是伴隨相應的新儀器而誕生的,否則無法進入生物學和醫學領域。
一些 NGS 技術需要首先進行待測DNA片段的PCR擴增。這些技術和儀器主要包括:①454基因組測序儀利用焦磷酸測序,檢測DNA合成產生的焦磷酸。綜合運用了乳液PCR、微流控芯片、焦磷酸檢測等技術。②Solexa/Illumina 測序儀檢測DNA合成反應中摻入的熒光標記單核苷酸,利用橋式PCR、微流控芯片、熒光標記基團和終止基團檢測等技術。③SOLiD測序儀基於寡核苷酸連接反應,利用乳液PCR、微流控芯片,檢測DNA連接酶催化的熒光標記寡核昔酸探針連接到DNA鏈過程中釋放出的光學信號。
更新一代的測序技術則無需PCR擴增反應,直接針對DNA單分子進行序列分析,亦稱為第三代測序技術。這些技術包括HeliScope 測序技術、單分子實時技術(single molecule real time technology, SMRT)以及基於熒光共振能量轉移(FRET)的測序技術等區。
高通量DNA測序技術的快速進步極大促進了人全基因組測序(wholegenome sequencing, WGS)、轉錄組測序(RNA-seq)、全外顯子測序(Exome-seq)、DNA-蛋白質相互作用,即染色質免疫共沉澱測序(ChIP-seq)、病原微生物全基因組測序等在醫學研究和實踐中的應用,為醫學進入大數據時代提供了核心技術支撐。

DNA測序在醫學領域具有廣泛應用價值[編輯]

DNA測序技術在醫學領域的使用日益廣泛和深入。DNA測序在醫學研究和臨床實踐中的主要用途是:①通過人群大樣本分析,確定單基因遺傳病和多基因變異相關疾病的SNP位點、基因結構變異、基因拷貝數變異等,鑑定出可用於複雜性疾病易感性預警或早期診斷的疾病標誌物,並將這些單一基因或多個基因的變異檢測用千臨床診斷。這些變異的發現還將指導治療靶點的確認和藥物研發;②檢測腫瘤組織的染色體畸變癌基因和抑癌基因突變位點、融合基因、染色體拷貝數變化等,為 腫瘤分子分型和治療敏感性監測提供依據;③進行個人基因組分析,在大數據平台發展的基礎上,建立個人 SNP 位點與疾病易感性、藥物敏感性和耐受性以及其他諸多表型之間的聯繫;④用於病原微生物檢測,確定病原微生物的分子分型,為抗病毒或細菌感染治療提供依據。
DNA測序在法醫學領域具有特殊意義。該技術極大提高了 DNA 鑑定的敏感性和準確性,在各類案件中作為司法證據的重要性越加凸顯。DNA測序在親子鑑定中亦具有重要價值。