生物化学与分子生物学/真核生物DNA复制过程

DNA的生物合成 - DNA复制的基本规律 - DNA复制的酶学和拓扑学 - 原核生物DNA复制过程 - 真核生物DNA复制过程 - 逆转录
真核生物的基因组复制在细胞分裂周期的DNA合成期(S期）进行。细胞周期进程在体内受到微环境中的增殖信号、营养条件等诸多因素影响，多种蛋白质因子和酶控制细胞进入S期的时机和DNA合成的速度。真核生物DNA合成的基本机制和特征与原核生物相似，但是由于基因组庞大及核小体的存在，反应体系、反应过程和调节均更为复杂。

真核生物DNA复制的起始与原核生物基本相似

真核生物DNA分布在许多染色体上，各自进行复制。每个染色体有上千个复制子，复制的起点很多。复制有时序性，就是说复制子以分组方式激活而不是同步启动。转录活性高的DNA在S期早期就进行复制。高度重复的序列如卫星DNA、连接染色体双倍体的部位即中心体(centrosome)和线性染色体两端即端粒(telomere)都是在S期的最后阶段才复制的。
真核生物复制起点序列较E.coli 的oriC 复杂。酵母DNA复制起点含llbp富含 AT的核心序列： A(T)TTTATA(G)TTTA(T) , 称为自主复制序列 (autonomous replication sequence, ARS)。也发现比E.coli 的oriC 序列长的真核生物复制起点。
真核生物复制起始也是打开双链形成复制叉，形成引发体和合成RNA引物。但详细的机制，包括酶及各种辅助蛋白质起作用的先后顺序，尚未完全明了。
复制的起始需要DNA pol α、pol ε和 pol δ的参与。此外还需解旋酶，拓扑酶和复制因子(replication factor, RF) , 如RFA、RFC等。
增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)在复制起始和延长中发挥关键作用。PCNA为同源三聚体，具有与E. coli DNA pol Ⅲ的β亚基相同的功能和相似的构象，即形成闭合环形的可滑动的DNA夹子，在RFC的作用下 PCNA结合于引物－模板链；并且PCNA使pol δ获得持续合成的能力。PCNA尚具有促进核小体生成的作用。PCNA的蛋白质水平也是检验细胞增殖能力的重要指标。

真核生物DNA复制的延长发生DNA聚合酶转换

现在认为与DNA pol α紧密结合的引发酶催化合成引物，DNA pol α最多在引物之后延伸15nt，然后迅速被具有连续合成能力的DNA pol δ和DNA pol ε所替换，这一过程称为聚合酶转换。DNA pol δ负责合成后随链，DNA pol ε负责合成前导链。真核生物是以复制子为单位各自进行复制的，所以引物和后随链的冈崎片段都比原核生物的短。
实验证明， 真核生物的冈崎片段长度大致与一个核小体 (nucleosome)所含DNA碱基数(135bp)或其若干倍相等。可见后随链的合成到核小体单位之末时，DNA pol δ会脱落，DNA pol α再引发下游引物合成，引物的引发频率是相当高的。pol α与pol δ之间的转换频率高，PCNA在全过程也要多次发挥作用。以上描述的实际是真核生物复制子内后随链的起始和延长交错进行的复制过程。前导链的连续复制，亦只限于半个复制子的长度。当后随链延长了一个或若干个核小体的长度后，要重新合成引物。 FENl和RNase H等负责去除真核复制RNA引物。
真核生物DNA合成，就酶的催化速率而言，远比原核生物慢，估算为50个dNTP/S。但真核生物是多复制子复制，总体速度是不慢的。 原核生物复制速度与其培养（营养）条件有关。真核生物在不同器官组织、不同发育时期和不同生理状况下，复制速度大不一样。

真核生物DNA合成后立即组装成核小体

复制后的DNA需要重新装配。原有的组蛋白及新合成的组蛋白结合到复制叉后的DNA链上，真核生物DNA合成后立即组装成核小体。生化分析和复制叉的图像一致表明，核小体的破坏仅局限在紧邻复制叉的一段短的区域内，复制叉的移动使核小体破坏，但是复制叉向前移动时，核小体在子链上迅速形成。
核小体组蛋白八聚体的数量是同期合成的一个核小体DNA长度的两倍，核素标记实验证明，原有组蛋白大部分可重新组装至DNA链上，但在S期细胞也大量、迅速地合成新的组蛋白。

端粒酶参与解决染色体末端复制问题

真核生物DNA复制与核小体装配同步进行，复制完成后随即组合成染色体并从G2期过渡到M期。染色体DNA是线性结构。复制中冈崎片段的连接，复制子之间的连接，都易于理解，因为均在线性DNA的内部完成。
染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。剩下的DNA单链母链如果不填补成双链，就会被核内DNase酶解。某些低等生物作为少数特例，染色体经多次复制会变得越来越短。早期的研究者们在研究真核生物复制终止时，曾假定有一种过渡性的环状结构帮助染色体末端复制的完成，后来一直未能证实这种环状结构的存在。然而，染色体在正常生理状况下复制，是可以保持其应有长度的。
端粒是真核生物染色体线性DNA分子的末端结构。形态学上，染色体DNA末端膨大成粒状，这是因为DNA和它的结合蛋白质紧密结合，像两顶帽子那样盖在染色体两端，因而得名。在某些情况下，染色体可以断裂，这时，染色体断端之间会发生融合或断端被DNA酶降解。但正常染色体不会整体地互相融合，也不会在末端出现遗传信息的丢失。可见，端粒在维持染色体的稳定性和DNA复制的完整性中有着重要的作用。DNA测序发现端粒结构的共同特点是富含T-G短序列的多次重复。如仓鼠和人类端粒DNA都有(Tn Gn)_x的重复序列，重复达数十至上百次，并能反折成二级结构。
20世纪80年代中期发现了端粒酶(telomerase)。1997年，人类端粒酶基因被克隆成功并鉴定了该酶由三部分组成：约451nt或150～1300nt的端粒酶RNA(human telomerase RNA, hTR)、端粒酶协同蛋白Ⅰ(human telomerase associated protein Ⅰ，hTPⅠ）和端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT)。该酶兼有提供RNA模板和催化逆转录的功能。
复制终止时，染色体端粒区域的DNA确有可能缩短或断裂。端粒酶通过一种称为爬行模型(inchworm model)的机制合成端粒DNA。端粒酶依靠hTR(An Cn)_x辨认及结合母链DNA(Tn Gn)_x的重复序列并移至其3'端，开始以逆转录的方式复制；复制一段后，hTR(An Cn)_x爬行移位至新合成的母链3'端，再以逆转录的方式复制延伸母链；延伸至足够长度后，端粒酶脱离母链，随后RNA引物酶以母链为模板合成引物，招募DNA pol, 以母链为模板，在DNA pol催化下填充子链，最后引物被去除。
研究发现，培养的人成纤维细胞随着培养传代次数增加，端粒长度逐渐缩短。生殖细胞中端粒长于体细胞，成年人细胞中端粒比胚胎细胞中端粒短。据上述的实验结果，至少可以认为在细胞水平，老化是和端粒酶活性下降有关的。当然，生物个体的老化，受多种环境因素和体内生理条件的影响，不能简单地归结为某单一因素的作用。
此外，在增殖活跃的肿瘤细胞中发现端粒酶活性增高。但在临床研究中也发现某些肿瘤细胞的端粒比正常同类细胞显著缩短。可见，端粒酶活性不一定与端粒的长度成正比。端粒和端粒酶的研究，在肿瘤学发病机制、寻找治疗靶点上，已经成为一个重要领域。

真核生物染色体DNA在每个细胞周期中只能复制一次

真核染色体DNA复制的一个重要特征是复制仅仅出现在细胞周期的S期，而且只能复制一次。染色体的任何一部分的不完全复制，均可能导致子代染色体分离时发生断裂和丢失。不适当的DNA复制也可能产生严重后果，如增加基因组中基因调控区的拷贝数，从而可能在基因表达、细胞分裂、对环境信号的应答等方面产生灾难性后果。
真核细胞DNA复制的起始分两步进行，即复制基因的选择和复制起点的激活，这两步分别出现千细胞周期的特定阶段 。复制基因(replicator)是指DNA复制起始所必需的全部DNA序列。复制基因的选择出现于G₁期，在这一阶段，基因组的每个复制基因位点均组装前复制复合物(pre-replicative complex, pre-RC) 。复制起点的激活仅出现于细胞进入S期以后，这一阶段将激活pre-RC ,募集若干复制基因结合蛋白和DNA聚合酶，并起始DNA解旋。
复制起点的激活与细胞周期进程一致。细胞周期蛋白D的水平在G₁后期升高，激活S期的CDK (cyclin-dependent kinase, CDK)。复制许可因子(replication licensing factor)是CDK的底物，为发动DNA复制所必需。复制许可因子一般不能通过核膜进入核内，但是在有丝分裂的末期、核膜重组之前可以进入细胞核，与DNA的复制起点结合 。等待被刺激进入S期的CDK激活，启动复制。一旦复制启动，复制许可因子即失去活性或被降解。在细胞周期的其他时间内，新的复制许可因子不能进入细胞核内，保证在一个细胞周期内只能进行一次基因组的复制。
在原核细胞中，复制基因的识别与DNA解旋、募集DNA聚合酶偶联进行。E.coli的复制基因是oriC。而在真核细胞中，这两个阶段相分离可以确保每个染色体在每个细胞周期中仅复制一次。

真核生物线粒体DNA按D环方式复制

D- 环复制(D-loop replication)是线粒体DNA的复制方式 。复制时需合成引物。mtDNA为闭合环状双链结构，第一个引物以内环为模板延伸。至第二个复制起点时，又合成另 一个反向引物，以外环为模板进行反向的延伸。最后完成两个双链环状 DNA的复制。复制中呈字母D形状而得名。D环复制的特点是复制起点不在双链DNA同一位点，内、外环复制有时序差别。
真核生物的DNA pol γ是线粒体催化DNA复制的DNA聚合酶。20世纪50年代以前，只知道DNA存在于细胞核染色体中。后来在细菌染色体外也发现能进行自我复制的DNA, 例如质粒，以后就利用质粒作为基因工程的常用载体。真核生物细胞器——线粒体，也发现存在mtDNA。人类的mtDNA已知有37个基因 。线粒体的功能是进行生物氧化和氧化磷酸化。其中13个mtDNA基因就是为ATP合成有关的蛋白质和酶编码的。其余24个基因转录为tRNA(22个）和rRNA(2个），参与线粒体蛋白质的合成。
mtDNA容易发生突变，损伤后的修复较困难。mtDNA的突变与衰老等自然现象有关，也和疾病的发生有关 。所以mtDNA的突变与修复，成为医学研究上引起广泛兴趣的科学问题。线粒体内蛋白质翻译时，使用的遗传密码和通用的密码有一些差别。