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生物化學與分子生物學/真核生物DNA複製過程

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DNA的生物合成 - DNA複製的基本規律 - DNA複製的酶學和拓撲學 - 原核生物DNA複製過程 - 真核生物DNA複製過程 - 逆轉錄
真核生物的基因組複製在細胞分裂周期的DNA合成期(S期)進行。細胞周期進程在體內受到微環境中的增殖信號、營養條件等諸多因素影響,多種蛋白質因子和酶控制細胞進入S期的時機和DNA合成的速度。真核生物DNA合成的基本機制和特徵與原核生物相似,但是由於基因組龐大及核小體的存在,反應體系、反應過程和調節均更為複雜。

真核生物DNA複製的起始與原核生物基本相似[編輯]

真核生物DNA分布在許多染色體上,各自進行複製。每個染色體有上千個複製子,複製的起點很多。複製有時序性,就是說複製子以分組方式激活而不是同步啟動。轉錄活性高的DNA在S期早期就進行複製。高度重複的序列如衛星DNA、連接染色體雙倍體的部位即中心體(centrosome)和線性染色體兩端即端粒(telomere)都是在S期的最後階段才複製的。
真核生物複製起點序列較E.colioriC 複雜。酵母DNA複製起點含llbp富含 AT的核心序列: A(T)TTTATA(G)TTTA(T) , 稱為自主複製序列 (autonomous replication sequence, ARS)。也發現比E.colioriC 序列長的真核生物複製起點。
真核生物複製起始也是打開雙鏈形成複製叉,形成引發體和合成RNA引物。但詳細的機制,包括酶及各種輔助蛋白質起作用的先後順序,尚未完全明了。
複製的起始需要DNA pol α、pol ε和 pol δ的參與。此外還需解旋酶,拓撲酶和複製因子(replication factor, RF) , 如RFA、RFC等。
增殖細胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)在複製起始和延長中發揮關鍵作用。PCNA為同源三聚體,具有與E. coli DNA pol Ⅲ的β亞基相同的功能和相似的構象,即形成閉合環形的可滑動的DNA夾子,在RFC的作用下 PCNA結合於引物-模板鏈;並且PCNA使pol δ獲得持續合成的能力。PCNA尚具有促進核小體生成的作用。PCNA的蛋白質水平也是檢驗細胞增殖能力的重要指標。

真核生物DNA複製的延長發生DNA聚合酶轉換[編輯]

現在認為與DNA pol α緊密結合的引發酶催化合成引物,DNA pol α最多在引物之後延伸15nt,然後迅速被具有連續合成能力的DNA pol δ和DNA pol ε所替換,這一過程稱為聚合酶轉換。DNA pol δ負責合成後隨鏈,DNA pol ε負責合成前導鏈。真核生物是以複製子為單位各自進行複製的,所以引物和後隨鏈的岡崎片段都比原核生物的短。
實驗證明, 真核生物的岡崎片段長度大致與一個核小體 (nucleosome)所含DNA鹼基數(135bp)或其若干倍相等。可見後隨鏈的合成到核小體單位之末時,DNA pol δ會脫落,DNA pol α再引發下游引物合成,引物的引發頻率是相當高的。pol α與pol δ之間的轉換頻率高,PCNA在全過程也要多次發揮作用。以上描述的實際是真核生物複製子內後隨鏈的起始和延長交錯進行的複製過程。前導鏈的連續複製,亦只限於半個複製子的長度。當後隨鏈延長了一個或若干個核小體的長度後,要重新合成引物。 FENl和RNase H等負責去除真核複製RNA引物。
真核生物DNA合成,就酶的催化速率而言,遠比原核生物慢,估算為50個dNTP/S。但真核生物是多複製子複製,總體速度是不慢的。 原核生物複製速度與其培養(營養)條件有關。真核生物在不同器官組織、不同發育時期和不同生理狀況下,複製速度大不一樣。

真核生物DNA合成後立即組裝成核小體[編輯]

複製後的DNA需要重新裝配。原有的組蛋白及新合成的組蛋白結合到複製叉後的DNA鏈上,真核生物DNA合成後立即組裝成核小體。生化分析和複製叉的圖像一致表明,核小體的破壞僅局限在緊鄰複製叉的一段短的區域內,複製叉的移動使核小體破壞,但是複製叉向前移動時,核小體在子鏈上迅速形成。
核小體組蛋白八聚體的數量是同期合成的一個核小體DNA長度的兩倍,核素標記實驗證明,原有組蛋白大部分可重新組裝至DNA鏈上,但在S期細胞也大量、迅速地合成新的組蛋白。

端粒酶參與解決染色體末端複製問題[編輯]

真核生物DNA複製與核小體裝配同步進行,複製完成後隨即組合成染色體並從G2期過渡到M期。染色體DNA是線性結構。複製中岡崎片段的連接,複製子之間的連接,都易於理解,因為均在線性DNA的內部完成。
染色體兩端DNA子鏈上最後複製的RNA引物,去除後留下空隙。剩下的DNA單鏈母鏈如果不填補成雙鏈,就會被核內DNase酶解。某些低等生物作為少數特例,染色體經多次複製會變得越來越短。早期的研究者們在研究真核生物複製終止時,曾假定有一種過渡性的環狀結構幫助染色體末端複製的完成,後來一直未能證實這種環狀結構的存在。然而,染色體在正常生理狀況下複製,是可以保持其應有長度的。
端粒是真核生物染色體線性DNA分子的末端結構。形態學上,染色體DNA末端膨大成粒狀,這是因為DNA和它的結合蛋白質緊密結合,像兩頂帽子那樣蓋在染色體兩端,因而得名。在某些情況下,染色體可以斷裂,這時,染色體斷端之間會發生融合或斷端被DNA酶降解。但正常染色體不會整體地互相融合,也不會在末端出現遺傳信息的丟失。可見,端粒在維持染色體的穩定性和DNA複製的完整性中有着重要的作用。DNA測序發現端粒結構的共同特點是富含T-G短序列的多次重複。如倉鼠和人類端粒DNA都有(Tn Gn)x的重複序列,重複達數十至上百次,並能反折成二級結構。
20世紀80年代中期發現了端粒酶(telomerase)。1997年,人類端粒酶基因被克隆成功並鑑定了該酶由三部分組成:約451nt或150~1300nt的端粒酶RNA(human telomerase RNA, hTR)、端粒酶協同蛋白Ⅰ(human telomerase associated protein Ⅰ,hTPⅠ)和端粒酶逆轉錄酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT)。該酶兼有提供RNA模板和催化逆轉錄的功能。
複製終止時,染色體端粒區域的DNA確有可能縮短或斷裂。端粒酶通過一種稱為爬行模型(inchworm model)的機制合成端粒DNA。端粒酶依靠hTR(An Cn)x辨認及結合母鏈DNA(Tn Gn)x的重複序列並移至其3'端,開始以逆轉錄的方式複製;複製一段後,hTR(An Cn)x爬行移位至新合成的母鏈3'端,再以逆轉錄的方式複製延伸母鏈;延伸至足夠長度後,端粒酶脫離母鏈,隨後RNA引物酶以母鏈為模板合成引物,招募DNA pol, 以母鏈為模板,在DNA pol催化下填充子鏈,最後引物被去除。
研究發現,培養的人成纖維細胞隨着培養傳代次數增加,端粒長度逐漸縮短。生殖細胞中端粒長於體細胞,成年人細胞中端粒比胚胎細胞中端粒短。據上述的實驗結果,至少可以認為在細胞水平,老化是和端粒酶活性下降有關的。當然,生物個體的老化,受多種環境因素和體內生理條件的影響,不能簡單地歸結為某單一因素的作用。
此外,在增殖活躍的腫瘤細胞中發現端粒酶活性增高。但在臨床研究中也發現某些腫瘤細胞的端粒比正常同類細胞顯著縮短。可見,端粒酶活性不一定與端粒的長度成正比。端粒和端粒酶的研究,在腫瘤學發病機制、尋找治療靶點上,已經成為一個重要領域。

真核生物染色體DNA在每個細胞周期中只能複製一次[編輯]

真核染色體DNA複製的一個重要特徵是複製僅僅出現在細胞周期的S期,而且只能複製一次。染色體的任何一部分的不完全複製,均可能導致子代染色體分離時發生斷裂和丟失。不適當的DNA複製也可能產生嚴重後果,如增加基因組中基因調控區的拷貝數,從而可能在基因表達、細胞分裂、對環境信號的應答等方面產生災難性後果。
真核細胞DNA複製的起始分兩步進行,即複製基因的選擇和複製起點的激活,這兩步分別出現千細胞周期的特定階段 。複製基因(replicator)是指DNA複製起始所必需的全部DNA序列。複製基因的選擇出現於G1期,在這一階段,基因組的每個複製基因位點均組裝前複製複合物(pre-replicative complex, pre-RC) 。複製起點的激活僅出現於細胞進入S期以後,這一階段將激活pre-RC ,募集若干複製基因結合蛋白和DNA聚合酶,並起始DNA解旋。
複製起點的激活與細胞周期進程一致。細胞周期蛋白D的水平在G1後期升高,激活S期的CDK (cyclin-dependent kinase, CDK)。複製許可因子(replication licensing factor)是CDK的底物,為發動DNA複製所必需。複製許可因子一般不能通過核膜進入核內,但是在有絲分裂的末期、核膜重組之前可以進入細胞核,與DNA的複製起點結合 。等待被刺激進入S期的CDK激活,啟動複製。一旦複製啟動,複製許可因子即失去活性或被降解。在細胞周期的其他時間內,新的複製許可因子不能進入細胞核內,保證在一個細胞周期內只能進行一次基因組的複製。
在原核細胞中,複製基因的識別與DNA解旋、募集DNA聚合酶偶聯進行。E.coli的複製基因是oriC。而在真核細胞中,這兩個階段相分離可以確保每個染色體在每個細胞周期中僅複製一次。

真核生物線粒體DNA按D環方式複製[編輯]

D- 環複製(D-loop replication)是線粒體DNA的複製方式 。複製時需合成引物。mtDNA為閉合環狀雙鏈結構,第一個引物以內環為模板延伸。至第二個複製起點時,又合成另 一個反向引物,以外環為模板進行反向的延伸。最後完成兩個雙鏈環狀 DNA的複製。複製中呈字母D形狀而得名。D環複製的特點是複製起點不在雙鏈DNA同一位點,內、外環複製有時序差別。
真核生物的DNA pol γ是線粒體催化DNA複製的DNA聚合酶。20世紀50年代以前,只知道DNA存在於細胞核染色體中。後來在細菌染色體外也發現能進行自我複製的DNA, 例如質粒,以後就利用質粒作為基因工程的常用載體。真核生物細胞器——線粒體,也發現存在mtDNA。人類的mtDNA已知有37個基因 。線粒體的功能是進行生物氧化和氧化磷酸化。其中13個mtDNA基因就是為ATP合成有關的蛋白質和酶編碼的。其餘24個基因轉錄為tRNA(22個)和rRNA(2個),參與線粒體蛋白質的合成。
mtDNA容易發生突變,損傷後的修復較困難。mtDNA的突變與衰老等自然現象有關,也和疾病的發生有關 。所以mtDNA的突變與修復,成為醫學研究上引起廣泛興趣的科學問題。線粒體內蛋白質翻譯時,使用的遺傳密碼和通用的密碼有一些差別。