生物化學與分子生物學/PCR實驗技術/PCR-SSCP操作步驟

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樣品製備[編輯]

  1. PCR擴增並檢測。根據不同的引物挑選適合的退火溫度進行PCR擴增。擴增產物用2-2.5%的瓊脂糖膠跑水平電泳檢測,上樣量3-5ul。PCR產物為10ng/nl左右為最佳。
  2. PCR產物與變性buffer混合。在乾淨的PCR管底部加入5ul  SSCP上樣緩衝液(變性緩衝液,同《分子克隆》中的測序緩衝液),然後在緩衝液中央加入PCR擴增產物。按照經驗,擴增效果在瓊脂糖膠上能看出比較亮的帶的樣品加1ul,效果很好加0.5ul,如果不太好就適當增加1.5、2或3不等,同時加大上樣緩衝液的量,比如加3ul的PCR產物,緩衝液加到8ul變性效果更好。
  3. PCR產物變性。加好的樣品進行離心,使樣品集中在管底。PCR儀上95℃變性10分鐘,立即取出PCR產物連同架子一同置於冰上靜置5min,以免變性的產物復性。

註:3和4步可以在制SSCP膠第四步後,等膠凝的過程中進行。

制膠[編輯]

  • 裝板。在所要進行實驗的每一副玻璃板先用自來水沖洗,然後使用ddH2O沖洗,然後使用吸水紙將玻璃板擦拭乾,然後再玻璃板上塗抹無水酒精,待2-3min酒精揮發。將玻璃板組裝好放入凝膠架子中,兩邊及底部固定好,兩玻璃板保持水平,然後將發條擰緊。(可用無水乙醇測試是否漏膠)。
  • 配膠。甘油濃度50%的幾種濃度大板膠(10ml下層膠,5ml 濃縮膠)配方(兩塊膠 1.0mm):
8%           6%
30%PAGE 2.7ml 1ml
10×TBE 1ml 0.5ml
50%甘油 1ml 0.5ml
ddH2O 5ml 3ml
APS 70ul 70ul
TEMED 12ul 8ul
Total 10ml 5ml

甘油濃度50%的幾種濃度小板膠(15ml下層膠,10ml 濃縮膠)配方(兩塊膠 1.5mm)

8% 6%
30%PAGE(4℃) 4.05ml 2 ml
10×TBE 1.5ml 1m
50%甘油 1.5m 1m
ddH2O 7.5ml 6ml
APS 105ul 70 ul
TEMED 12ul 12ul
Total 15ml 10ml
  • 灌膠。配好膠後攪勻,灌入裝好的玻璃板中,注意不能產生氣泡,如果產生氣泡把板立起,輕輕敲打可使氣泡升出膠面,膠面與凹板上沿大約差0.5cm時插上梳子,要保證梳子齒和液面接觸處沒有氣泡,一旦產生要拔出重插。
  • 靜置。灌好的膠平放或與水平成一比較小的角度(10o以下)靜置水平桌面上30min左右使之充分聚合。 註:此時可以進行PCR樣品變性,即第一部分的3、4步。

上樣[編輯]

  1. 安板。PAGE聚合好後要及時拔出梳子(時間耽擱長後會使梳子很難拔出),拔梳子時要用力均勻以保持膠孔的整齊。用夾子把膠板固定在電泳槽上,凹槽的一面朝里,安板時首先使板的底邊一端先接觸電泳液,再緩慢地過度到另一端,以免產生大氣泡(產生大氣泡會使電泳條帶彎曲)。
  2. 預電泳。從底槽把一些電泳液1×TBE吸到上槽,使液面高出玻璃板矮邊1cm以上,並確保上槽不漏液。打開電源,大槽電壓調到140-150V,小槽110-120V,預電泳10min左右。(0.1W/cm,10℃,1-3h)
  3. 點樣。用微量進樣器把準備好的樣品按順序加到膠孔中。由於邊緣效應帶型不整齊,每塊板中最邊上的兩個孔最好不要點樣。
  4. 電泳。大槽電壓140-150V,小槽110-120V,溫度在10-15℃,恆溫電泳10個小時以上。

染色[編輯]

  1. 固定。把膠卸下,做好起始記號,放入70%乙醇中在搖床上固定15min。固定好後乙醇回收(可以重複使用5次左右),蒸餾水洗兩遍,每遍3min左右。若同時染兩塊膠固定和洗脫都要適當增加時間。
  2. 染色。染色液(200ml染色液含3.6%的NaOH4.2ml、20%AgNO33.6ml、氨水2ml)染色30min,同時染兩塊膠要適當增加時間,需40min左右。倒掉染色液,洗3遍,每遍3min,同時染兩塊膠要適當增加時間。
  3. 顯色。顯色液(200ml顯色液包含1%檸檬酸鈉1ml,甲醛100ul)至清晰。倒掉顯色液,加蒸餾洗脫3次停顯。

(也可將凝膠浸在含 0.5ug/ml溴化錠的1×TBE緩衝液中染色10min,在紫外燈下觀察)

附錄[編輯]

  • 甘油濃度50%的幾種濃度大板膠(10ml下層膠,5ml 濃縮膠)配方(兩塊膠 1.0mm):
8%           6%
30%PAGE 2.7ml 1ml
10×TBE 1ml 0.5ml
50%甘油 1ml 0.5ml
ddH2O 5ml 3ml
APS 70ul 70ul
TEMED 12ul 8ul
Total 10ml 5ml
  • 甘油濃度50%的幾種濃度小板膠(15ml下層膠,10ml 濃縮膠)配方(兩塊膠 1.5mm)
8% 6%
30%PAGE 4.05ml 2 ml
10×TBE 1.5ml 1m
50%甘油 1.5m 1m
ddH2O 7.5ml 6ml
APS 105ul 70 ul
TEMED 12ul 12ul
Total 15ml 10ml
  • 10×TBE的配方:108g Tris鹼、55g硼酸、40ml 0.5mol/lEDTA(pH8.0)定容1L
  • 變性buffer的配方:98%去離子甲醯胺、10mmol/LEDTA(pH8.0)、0.025%二甲苯青FF、0.025%溴酚藍

注意事項[編輯]

  • ①重複性.影響SSCP重複性的主要因素為電泳的電壓和溫度.這兩個條件保持不變, SSCP圖譜可保持良好的重複性.一般SSCP圖譜是二條單鏈DNA帶,但有時有的DNA片段 可能只呈現一條SSDNA帶,或者三條以上,這主要是由於兩條單鏈DNA之間存在相似的立體構象.有時三條以上的SSCP圖譜是由於野型DNA片段和突變型DNA片段共同存在的結果.
  • ②靶DNA序列長度的影響在實驗中發現SSCP對短鏈DNA或RNA的點突變檢出率要比長鏈的高,這可能是由於長鏈DNA和RNA分子中單個鹼基的改變在維持立體構象中起的作用較小的緣故.而有人認為在DNA鏈較短的(400bp以下)情況下,DNA的長度不會影響SSCP 的效果.
  • ③電泳電壓和溫度的影響:為了使單鏈DNA保持一定的穩定立體構象,SSCP應在較低溫 度下進行(一般4℃-15℃之間).在電泳過程中除環境溫度外,電壓過高也是引起溫度升高的主要原因,因此,在沒有冷卻裝置的電泳槽上進行SSCP時,開始的5min應用較 高的電壓(250V),以後用100V左右電壓進行電泳.這主要是由於開始的高電壓可以使不同立體構象的單鏈DNA初步分離,而凝膠的溫度不會升高.隨後的低電壓電泳可以使 之進一步分離.在實驗中應根據具體實驗條件確定電泳電壓.
  • ④SSCP的結果斷定:由於在SSCP分析中非變性PAG電泳不是根據單鏈DNA分子和帶電量 的大小來分離的,而是以單鏈DNA片段空間構象的立體位阻大小來實現分離的,因此,這種分離不能反映出分子量的大小.有時正常鏈與突變鏈的遷移率很接近,很難看出兩者之間的差別.因此一般要求電泳長度在16--18cm以上,以檢測限為指標來判定結果.檢測限是指突變DNA片段與正常DNA片段可分辨的電泳距離差的最小值.大於檢測限則判定鏈的遷移率有改變,說明該DNA序列有變化,小於檢測限則說明鏈之間無變化.例如,一般檢測限定為3mm,那麼當兩帶間距離在3mm以上,則說明兩鏈之間有改變.另外檢測限不能定的太低,否則主觀因素太大,易造成假陽性結果.另外,SSCP 分析中其它條件,如PCR產物的上樣量,PAG的交聯度、以及膠的濃度等,都應根據具 體實驗進行選擇確定.