生物化學與分子生物學/PCR實驗技術/PCR-SSCP操作步驟
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樣品製備
[編輯]- PCR擴增並檢測。根據不同的引子挑選適合的退火溫度進行PCR擴增。擴增產物用2-2.5%的瓊脂糖膠跑水平電泳檢測，上樣量3-5ul。PCR產物為10ng/nl左右為最佳。
- PCR產物與變性buffer混合。在乾淨的PCR管底部加入5ul SSCP上樣緩衝液（變性緩衝液，同《分子克隆》中的測序緩衝液），然後在緩衝液中央加入PCR擴增產物。按照經驗，擴增效果在瓊脂糖膠上能看出比較亮的帶的樣品加1ul，效果很好加0.5ul，如果不太好就適當增加1.5、2或3不等，同時加大上樣緩衝液的量，比如加3ul的PCR產物，緩衝液加到8ul變性效果更好。
- PCR產物變性。加好的樣品進行離心，使樣品集中在管底。PCR儀上95℃變性10分鐘，立即取出PCR產物連同架子一同置於冰上靜置5min，以免變性的產物復性。
註：3和4步可以在制SSCP膠第四步後，等膠凝的過程中進行。
制膠
[編輯]- 裝板。在所要進行實驗的每一副玻璃板先用自來水沖洗，然後使用ddH2O沖洗，然後使用吸水紙將玻璃板擦拭乾，然後再玻璃板上塗抹無水酒精，待2-3min酒精揮發。將玻璃板組裝好放入凝膠架子中，兩邊及底部固定好，兩玻璃板保持水平，然後將發條擰緊。（可用無水乙醇測試是否漏膠）。
- 配膠。甘油濃度50%的幾種濃度大板膠（10ml下層膠，5ml 濃縮膠）配方（兩塊膠 1.0mm）：
| 8% | 6% | |
| 30%PAGE | 2.7ml | 1ml |
| 10×TBE | 1ml | 0.5ml |
| 50%甘油 | 1ml | 0.5ml |
| ddH2O | 5ml | 3ml |
| APS | 70ul | 70ul |
| TEMED | 12ul | 8ul |
| Total | 10ml | 5ml |
甘油濃度50%的幾種濃度小板膠（15ml下層膠，10ml 濃縮膠）配方（兩塊膠 1.5mm）
| 8% | 6% | |
| 30%PAGE（4℃） | 4.05ml | 2 ml |
| 10×TBE | 1.5ml | 1m |
| 50%甘油 | 1.5m | 1m |
| ddH2O | 7.5ml | 6ml |
| APS | 105ul | 70 ul |
| TEMED | 12ul | 12ul |
| Total | 15ml | 10ml |
- 灌膠。配好膠後攪勻，灌入裝好的玻璃板中，注意不能產生氣泡，如果產生氣泡把板立起，輕輕敲打可使氣泡升出膠面，膠面與凹板上沿大約差0.5cm時插上梳子，要保證梳子齒和液面接觸處沒有氣泡，一旦產生要拔出重插。
- 靜置。灌好的膠平放或與水平成一比較小的角度（10o以下）靜置水平桌面上30min左右使之充分聚合。 註：此時可以進行PCR樣品變性，即第一部分的3、4步。
上樣
[編輯]- 安板。PAGE聚合好後要及時拔出梳子（時間耽擱長後會使梳子很難拔出），拔梳子時要用力均勻以保持膠孔的整齊。用夾子把膠板固定在電泳槽上，凹槽的一面朝里，安板時首先使板的底邊一端先接觸電泳液，再緩慢地過度到另一端，以免產生大氣泡（產生大氣泡會使電泳條帶彎曲）。
- 預電泳。從底槽把一些電泳液1×TBE吸到上槽，使液面高出玻璃板矮邊1cm以上，並確保上槽不漏液。打開電源，大槽電壓調到140-150V，小槽110-120V，預電泳10min左右。(0.1W/cm,10℃，1-3h)
- 點樣。用微量進樣器把準備好的樣品按順序加到膠孔中。由於邊緣效應帶型不整齊，每塊板中最邊上的兩個孔最好不要點樣。
- 電泳。大槽電壓140-150V，小槽110-120V，溫度在10-15℃，恆溫電泳10個小時以上。
染色
[編輯]- 固定。把膠卸下，做好起始記號，放入70%乙醇中在搖床上固定15min。固定好後乙醇回收（可以重複使用5次左右），蒸餾水洗兩遍，每遍3min左右。若同時染兩塊膠固定和洗脫都要適當增加時間。
- 染色。染色液（200ml染色液含3.6%的NaOH4.2ml、20%AgNO33.6ml、氨水2ml）染色30min，同時染兩塊膠要適當增加時間，需40min左右。倒掉染色液，洗3遍，每遍3min，同時染兩塊膠要適當增加時間。
- 顯色。顯色液（200ml顯色液包含1%檸檬酸鈉1ml，甲醛100ul）至清晰。倒掉顯色液，加蒸餾洗脫3次停顯。
(也可將凝膠浸在含 0.5ug/ml溴化錠的1×TBE緩衝液中染色10min，在紫外燈下觀察)
附錄
[編輯]- 甘油濃度50%的幾種濃度大板膠（10ml下層膠，5ml 濃縮膠）配方（兩塊膠 1.0mm）：
| 8% | 6% | |
| 30%PAGE | 2.7ml | 1ml |
| 10×TBE | 1ml | 0.5ml |
| 50%甘油 | 1ml | 0.5ml |
| ddH2O | 5ml | 3ml |
| APS | 70ul | 70ul |
| TEMED | 12ul | 8ul |
| Total | 10ml | 5ml |
- 甘油濃度50%的幾種濃度小板膠（15ml下層膠，10ml 濃縮膠）配方（兩塊膠 1.5mm）
| 8% | 6% | |
| 30%PAGE | 4.05ml | 2 ml |
| 10×TBE | 1.5ml | 1m |
| 50%甘油 | 1.5m | 1m |
| ddH2O | 7.5ml | 6ml |
| APS | 105ul | 70 ul |
| TEMED | 12ul | 12ul |
| Total | 15ml | 10ml |
- 10×TBE的配方：108g Tris鹼、55g硼酸、40ml 0.5mol/lEDTA(pH8.0)定容1L
- 變性buffer的配方：98%去離子甲醯胺、10mmol/LEDTA(pH8.0)、0.025%二甲苯青FF、0.025%溴酚藍
注意事項
[編輯]- ①重複性.影響SSCP重複性的主要因素為電泳的電壓和溫度.這兩個條件保持不變， SSCP圖譜可保持良好的重複性.一般SSCP圖譜是二條單鏈DNA帶，但有時有的DNA片段 可能只呈現一條SSDNA帶，或者三條以上，這主要是由於兩條單鏈DNA之間存在相似的立體構象.有時三條以上的SSCP圖譜是由於野型DNA片段和突變型DNA片段共同存在的結果.
- ②靶DNA序列長度的影響在實驗中發現SSCP對短鏈DNA或RNA的點突變檢出率要比長鏈的高，這可能是由於長鏈DNA和RNA分子中單個鹼基的改變在維持立體構象中起的作用較小的緣故.而有人認為在DNA鏈較短的(400bp以下)情況下，DNA的長度不會影響SSCP 的效果.
- ③電泳電壓和溫度的影響:為了使單鏈DNA保持一定的穩定立體構象，SSCP應在較低溫 度下進行(一般4℃-15℃之間).在電泳過程中除環境溫度外，電壓過高也是引起溫度升高的主要原因，因此，在沒有冷卻裝置的電泳槽上進行SSCP時，開始的5min應用較 高的電壓(250V)，以後用100V左右電壓進行電泳.這主要是由於開始的高電壓可以使不同立體構象的單鏈DNA初步分離，而凝膠的溫度不會升高.隨後的低電壓電泳可以使 之進一步分離.在實驗中應根據具體實驗條件確定電泳電壓.
- ④SSCP的結果斷定:由於在SSCP分析中非變性PAG電泳不是根據單鏈DNA分子和帶電量 的大小來分離的，而是以單鏈DNA片段空間構象的立體位阻大小來實現分離的，因此，這種分離不能反映出分子量的大小.有時正常鏈與突變鏈的遷移率很接近，很難看出兩者之間的差別.因此一般要求電泳長度在16--18cm以上，以檢測限為指標來判定結果.檢測限是指突變DNA片段與正常DNA片段可分辨的電泳距離差的最小值.大於檢測限則判定鏈的遷移率有改變，說明該DNA序列有變化，小於檢測限則說明鏈之間無變化.例如，一般檢測限定為3mm，那麼當兩帶間距離在3mm以上，則說明兩鏈之間有改變.另外檢測限不能定的太低，否則主觀因素太大，易造成假陽性結果.另外，SSCP 分析中其它條件，如PCR產物的上樣量，PAG的交聯度、以及膠的濃度等，都應根據具 體實驗進行選擇確定.