生物化学与分子生物学/PCR实验技术/PCR-SSCP操作步骤
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样品制备
[编辑]- PCR扩增并检测。根据不同的引物挑选适合的退火温度进行PCR扩增。扩增产物用2-2.5%的琼脂糖胶跑水平电泳检测，上样量3-5ul。PCR产物为10ng/nl左右为最佳。
- PCR产物与变性buffer混合。在干净的PCR管底部加入5ul SSCP上样缓冲液（变性缓冲液，同《分子克隆》中的测序缓冲液），然后在缓冲液中央加入PCR扩增产物。按照经验，扩增效果在琼脂糖胶上能看出比较亮的带的样品加1ul，效果很好加0.5ul，如果不太好就适当增加1.5、2或3不等，同时加大上样缓冲液的量，比如加3ul的PCR产物，缓冲液加到8ul变性效果更好。
- PCR产物变性。加好的样品进行离心，使样品集中在管底。PCR仪上95℃变性10分钟，立即取出PCR产物连同架子一同置于冰上静置5min，以免变性的产物复性。
注：3和4步可以在制SSCP胶第四步后，等胶凝的过程中进行。
制胶
[编辑]- 装板。在所要进行实验的每一副玻璃板先用自来水冲洗，然后使用ddH2O冲洗，然后使用吸水纸将玻璃板擦拭干，然后再玻璃板上涂抹无水酒精，待2-3min酒精挥发。将玻璃板组装好放入凝胶架子中，两边及底部固定好，两玻璃板保持水平，然后将发条拧紧。（可用无水乙醇测试是否漏胶）。
- 配胶。甘油浓度50%的几种浓度大板胶（10ml下层胶，5ml 浓缩胶）配方（两块胶 1.0mm）：
| 8% | 6% | |
| 30%PAGE | 2.7ml | 1ml |
| 10×TBE | 1ml | 0.5ml |
| 50%甘油 | 1ml | 0.5ml |
| ddH2O | 5ml | 3ml |
| APS | 70ul | 70ul |
| TEMED | 12ul | 8ul |
| Total | 10ml | 5ml |
甘油浓度50%的几种浓度小板胶（15ml下层胶，10ml 浓缩胶）配方（两块胶 1.5mm）
| 8% | 6% | |
| 30%PAGE（4℃） | 4.05ml | 2 ml |
| 10×TBE | 1.5ml | 1m |
| 50%甘油 | 1.5m | 1m |
| ddH2O | 7.5ml | 6ml |
| APS | 105ul | 70 ul |
| TEMED | 12ul | 12ul |
| Total | 15ml | 10ml |
- 灌胶。配好胶后搅匀，灌入装好的玻璃板中，注意不能产生气泡，如果产生气泡把板立起，轻轻敲打可使气泡升出胶面，胶面与凹板上沿大约差0.5cm时插上梳子，要保证梳子齿和液面接触处没有气泡，一旦产生要拔出重插。
- 静置。灌好的胶平放或与水平成一比较小的角度（10o以下）静置水平桌面上30min左右使之充分聚合。 注：此时可以进行PCR样品变性，即第一部分的3、4步。
上样
[编辑]- 安板。PAGE聚合好后要及时拔出梳子（时间耽搁长后会使梳子很难拔出），拔梳子时要用力均匀以保持胶孔的整齐。用夹子把胶板固定在电泳槽上，凹槽的一面朝里，安板时首先使板的底边一端先接触电泳液，再缓慢地过度到另一端，以免产生大气泡（产生大气泡会使电泳条带弯曲）。
- 预电泳。从底槽把一些电泳液1×TBE吸到上槽，使液面高出玻璃板矮边1cm以上，并确保上槽不漏液。打开电源，大槽电压调到140-150V，小槽110-120V，预电泳10min左右。(0.1W/cm,10℃，1-3h)
- 点样。用微量进样器把准备好的样品按顺序加到胶孔中。由于边缘效应带型不整齐，每块板中最边上的两个孔最好不要点样。
- 电泳。大槽电压140-150V，小槽110-120V，温度在10-15℃，恒温电泳10个小时以上。
染色
[编辑]- 固定。把胶卸下，做好起始记号，放入70%乙醇中在摇床上固定15min。固定好后乙醇回收（可以重复使用5次左右），蒸馏水洗两遍，每遍3min左右。若同时染两块胶固定和洗脱都要适当增加时间。
- 染色。染色液（200ml染色液含3.6%的NaOH4.2ml、20%AgNO33.6ml、氨水2ml）染色30min，同时染两块胶要适当增加时间，需40min左右。倒掉染色液，洗3遍，每遍3min，同时染两块胶要适当增加时间。
- 显色。显色液（200ml显色液包含1%柠檬酸钠1ml，甲醛100ul）至清晰。倒掉显色液，加蒸馏洗脱3次停显。
(也可将凝胶浸在含 0.5ug/ml溴化锭的1×TBE缓冲液中染色10min，在紫外灯下观察)
附录
[编辑]- 甘油浓度50%的几种浓度大板胶（10ml下层胶，5ml 浓缩胶）配方（两块胶 1.0mm）：
| 8% | 6% | |
| 30%PAGE | 2.7ml | 1ml |
| 10×TBE | 1ml | 0.5ml |
| 50%甘油 | 1ml | 0.5ml |
| ddH2O | 5ml | 3ml |
| APS | 70ul | 70ul |
| TEMED | 12ul | 8ul |
| Total | 10ml | 5ml |
- 甘油浓度50%的几种浓度小板胶（15ml下层胶，10ml 浓缩胶）配方（两块胶 1.5mm）
| 8% | 6% | |
| 30%PAGE | 4.05ml | 2 ml |
| 10×TBE | 1.5ml | 1m |
| 50%甘油 | 1.5m | 1m |
| ddH2O | 7.5ml | 6ml |
| APS | 105ul | 70 ul |
| TEMED | 12ul | 12ul |
| Total | 15ml | 10ml |
- 10×TBE的配方：108g Tris碱、55g硼酸、40ml 0.5mol/lEDTA(pH8.0)定容1L
- 变性buffer的配方：98%去离子甲酰胺、10mmol/LEDTA(pH8.0)、0.025%二甲苯青FF、0.025%溴酚蓝
注意事项
[编辑]- ①重复性.影响SSCP重复性的主要因素为电泳的电压和温度.这两个条件保持不变， SSCP图谱可保持良好的重复性.一般SSCP图谱是二条单链DNA带，但有时有的DNA片段 可能只呈现一条SSDNA带，或者三条以上，这主要是由于两条单链DNA之间存在相似的立体构象.有时三条以上的SSCP图谱是由于野型DNA片段和突变型DNA片段共同存在的结果.
- ②靶DNA序列长度的影响在实验中发现SSCP对短链DNA或RNA的点突变检出率要比长链的高，这可能是由于长链DNA和RNA分子中单个碱基的改变在维持立体构象中起的作用较小的缘故.而有人认为在DNA链较短的(400bp以下)情况下，DNA的长度不会影响SSCP 的效果.
- ③电泳电压和温度的影响:为了使单链DNA保持一定的稳定立体构象，SSCP应在较低温 度下进行(一般4℃-15℃之间).在电泳过程中除环境温度外，电压过高也是引起温度升高的主要原因，因此，在没有冷却装置的电泳槽上进行SSCP时，开始的5min应用较 高的电压(250V)，以后用100V左右电压进行电泳.这主要是由于开始的高电压可以使不同立体构象的单链DNA初步分离，而凝胶的温度不会升高.随后的低电压电泳可以使 之进一步分离.在实验中应根据具体实验条件确定电泳电压.
- ④SSCP的结果断定:由于在SSCP分析中非变性PAG电泳不是根据单链DNA分子和带电量 的大小来分离的，而是以单链DNA片段空间构象的立体位阻大小来实现分离的，因此，这种分离不能反映出分子量的大小.有时正常链与突变链的迁移率很接近，很难看出两者之间的差别.因此一般要求电泳长度在16--18cm以上，以检测限为指标来判定结果.检测限是指突变DNA片段与正常DNA片段可分辨的电泳距离差的最小值.大于检测限则判定链的迁移率有改变，说明该DNA序列有变化，小于检测限则说明链之间无变化.例如，一般检测限定为3mm，那么当两带间距离在3mm以上，则说明两链之间有改变.另外检测限不能定的太低，否则主观因素太大，易造成假阳性结果.另外，SSCP 分析中其它条件，如PCR产物的上样量，PAG的交联度、以及胶的浓度等，都应根据具 体实验进行选择确定.