生物化学与分子生物学/蛋白质的分离、纯化与结构分析

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蛋白质是生物大分子，具有胶体性质、沉淀、变性和凝固等特点。人体的细胞和体液中存在成千上万种蛋白质，要分析其中某种蛋白质的结构和功能，需要从混合物分离纯化出单一蛋白质。蛋白质 分离通常是利用其特殊理化性质，采取盐析、透析、电泳、层析及超速离心等不损伤蛋白质空间构象的物理方法， 以满足研究蛋白质结构与功能的需要。

蛋白质沉淀用于蛋白质浓缩及分离

蛋白质在溶液中一般含量较低，需要经沉淀浓缩，以利进一步分离纯化。

1. 有机溶剂沉淀蛋白质 丙酮、乙醇等有机溶剂可以使蛋白质沉淀，再将其溶解在小体积溶剂中即可获得浓缩的蛋白质溶液。为保持蛋白质的结构和生物活性，需要在0～4℃低温下进行丙酮或乙醇沉淀，沉淀后应立即分离，否则蛋白质会发生变性。
2. 盐析分离蛋白质 盐析(salt precipitation)是将硫酸按、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素去除而沉淀。各种蛋白质盐析时所需的盐浓度及 pH 均不同，可据此将不同的蛋白质予以分离。例如血清中的清蛋白和球蛋白，前者可溶于pH 7.0 左右的半饱和硫酸按溶液中，而后者在此溶液中则发生沉淀。当硫酸按溶液达到饱和时，清蛋白也随之析出。所以盐析法可将蛋白质初步分离，但欲得纯品，尚需用其他方法。许多蛋白质经纯化后，在盐溶液中长期放置逐渐析出，成为整齐的结晶。
3. 免疫沉淀分离蛋白质 蛋白质具有抗原性，将某种纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白质的特异抗体。利用特异抗体识别相应抗原并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。这就是可用于特定蛋白质定性和定量分析的免疫沉淀法。在具体实验中，常将抗体交联至固相化的琼脂糖珠上，易于获得抗原抗体复合物。进一步将抗原抗体复合物溶于含十二烷基硫酸钠和二琉基丙醇的缓冲液后加热，使抗原从抗原抗体复合物分离而得以纯化，并用于分析。

透析和超滤法去除蛋白质溶液中的小分子化合物

利用透析袋将大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法称为透析(dialysis)。透析袋是用具有超小微孔的膜，如硝酸纤维素膜制成，一般只允许分子量为lOkD以下的化合物通过。将蛋白质溶液装在透析袋内置于水中，硫酸按氯化钠等小分子物质可透过薄膜进入水溶液，由此可对盐析浓缩后的蛋白质溶液进行除盐。如果透析袋外放放置吸水剂如聚乙二醇，则袋内水分伴同小分子物质透出袋外，高分子量的蛋白质留在袋内，可达到浓缩目的。同样，应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的，称为超滤法闷。此法简便且回收率高，是常用的浓缩蛋白质溶液方法。

电泳分离蛋白质

蛋白质在高于或低于其pI的溶液中成为带电颗粒，在电场中能向正极或负极方向移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术称为电泳(electrophoresis)。根据支撑物的不同有纤维薄膜电泳、凝胶电泳等。薄膜电泳是将蛋白质溶液点样于薄膜上，薄膜两端分别加正、负电极，此时带正电荷的蛋白质向负极泳动；带负电荷的蛋白质向正极泳动；带电多，分子量小的蛋白质泳动速率快；带电少，分子量大的则泳动慢，于是蛋白质被分离。凝胶电泳的支撑物为琼脂糖、淀粉或聚丙烯酰胺凝胶。凝胶置于玻璃板上或玻璃管中，凝胶两端分别加上正、负电极，蛋白质混合液即在凝胶中泳动。电泳结束后，用蛋白质显色剂显色，即可看到多条已被分离的蛋白质色带。

1. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质 若蛋白质样品和聚丙烯酰胺凝胶系统中加入带负电荷较多的十二烷基硫酸钠(SDS),使所有蛋白质颗粒表面覆盖一层 SDS 分子，导致蛋白质分子间的电荷差异消失，此时蛋白质在电场中的泳动速率仅与蛋白质颗粒大小有关，加之聚丙烯酰胺凝胶具有分子筛效应，因而此种称之为 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-polyac1ylarnide gel eiectrophoresis, SDS-PAGE)。
2. 等点聚焦电泳分离蛋白质 如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入系列两性电解质载体，在电场中可形成一个连续而稳定的线性 pH 梯度，即 pH 从凝胶的正极向负极依次递增。在这种介质中电泳时，被分离的蛋白质处在偏离其等电点的 pH 位置时带有电荷而移动，当蛋白质泳动至与其自身的 pI值相等的 pH 区域时，其净电荷为零而不再移动，这种通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法称为等电聚焦电泳(isoelectric equilibrium electrophoresis, IEE)。
3. 双向凝胶电泳分离蛋白质 人类基因组计划完成后迎来了后基因组时代，其中蛋白质组学的研究颇受重视。双向凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE)是蛋白质组学研究的重要技术之一。双向凝胶电泳的第一向是蛋白质的IEE,第二向为SDS-PAGE,利用被分离蛋白质等电点和分子量的差异，将复杂蛋白质混合物在二维平面上分离。

层析分离蛋白质

层析(chromatography)是分离、纯化蛋白质的重要手段之一。一般而言，待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。层析种类很多，有离子交换层析、凝胶过滤和亲和层析等。其中离子交换层析和凝胶过滤应用最广。
蛋白质和氨基酸一样，是两性电解质，在某一特定pH时，各蛋白质的电荷量及性质不同，故可以通过离子交换层析得以分离。凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析。层析柱内填满带有小孔的颗粒，一般由葡聚糖制成。蛋白质溶液加于柱之顶部，任其往下渗漏，小分子蛋白质进入孔内，因而在柱中滞留时间较长，大分子蛋白质不能进入孔内而径直流出，因此不同大小的蛋白质得以分离。

蛋白质颗粒沉降行为与超速离心分离

超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。蛋白质在高达500 OOOg(g为gravity,即地心引力单位）的重力作用下，在溶液中逐渐沉降，直至其浮力(buoyant force)与离心所产生的力相等，此时沉降停止。不同蛋白质其密度与形态各不相同，因此用上述方法可将它们分开。蛋白质在离心力场中的沉降行为用沉降系数(sedimentation coefficient, S)表示，沉降系数(S)使用Svedberg单位(lS=l0^-13秒）。S与蛋白质的密度和形状相关。

蛋白质的一级结构分析

F. Sanger耗时多年才在1953年基本完成了胰岛素的一级结构测定，现今由于方法学改进及自动化分析仪器的产生，已有越来越多蛋白质的氨基酸序列问世。
1、离子交换层析分析蛋白质的氨基酸组分 首先分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成。蛋白质经盐酸水解后成为个别氨基酸，用离子交换树脂将各种氨基酸分开，测定它们的量，算出各氨基酸在蛋白质中的百分组成或个数。
2、测定多肽链的氨基端和羧基端的氨基酸残基 第二步测定多肽链的氨基端与羧基端为何种氨基酸残基。F.Sanger 最初用二硝基氟苯与多肽链的α-氨基作用生成二硝基苯氨基酸，然后将多肽水解，分离出带有二硝基苯基的氨基酸。目前多用丹酰氯使之生成丹酰衍生物，该物质具强烈荧光，更易鉴别。羧基端氨基酸残基可用羧肽酶将其水解下来进行鉴定。
3、肽链序列的测定 第三步是将肽链水解成片段，分别进行分析。常用者有胰蛋白酶法、胰凝乳蛋白酶法、溴化氛法等。胰蛋白酶能水解赖氨酸或精氨酸的羧基所形成的肽键。所以如果蛋白质分子中有4个精氨酸及赖氨酸残基，则可得5个片段。胰凝乳蛋白酶水解芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸）羧基侧的肽键，溴化氰水解甲硫氨酸羧基侧的肽键。
蛋白质水解生成的肽段，可通过层析和电泳及质谱将其分离纯化并鉴定，得到的图谱称为肽图 (peptide map), 由此可明确肽段的大小和数量。各肽段的氨基酸排列顺序一般采用 Edman 降解法进行分析。将待测肽段先与异硫氰酸苯酯反应，该试剂只与氨基端氨基酸的游离α-氨基作用。再用冷稀酸处理，氨基端残基即自肽链脱落下来，成为异硫氰酸苯酯衍生物，用层析可鉴定为何种氨基酸衍生物。残留的肽链可继续与异硫氰酸苯酯作用，依次逐个鉴定出氨基酸的排列顺序。对分 析出的各肽段中的氨基酸顺序，进行组合排列对比，最终得出完整肽链中的氨基酸排列顺序。
近年来，由于核酸研究在理论上及技术上的迅猛发展，尤其是人全基因组测序的完成，各种蛋白 质的氨基酸序列已经可以通过核酸序列来推演。然而，蛋白质组学研究、生物制药产品的鉴定等仍需要进行高效而准确的蛋白质的部分一级结构分析。

蛋白质的空间结构分析

大量生物体内存在的蛋白质空间结构的解析，对于研究蛋白质结构与功能的内在关系至关重要，也为蛋白质或多肽药物的结构改造以致增强作用减弱副作用提供了理论依据。由于蛋白质的空间结构十分复杂，因而其测定的难度也较大，而且还需昂贵的仪器设备和先进的技术。随着结构生物学的 发展，蛋白质二级结构和三维空间结构的测定也已普遍开展。 1、圆二色光谱法测定蛋白质二级结构 通常采用圆二色光谱(circular dichroism, CD)测定溶液状态下的蛋白质二级结构。CD谱对二级结构非常敏感，α-螺旋的CD峰有222nm处的负峰、208nm处的负峰和198nm处的正峰等3个成分；而β-折叠的CD谱不很固定。可见测定含α-螺旋较多的蛋白质，所得结果更为准确。
2、蛋白质三维空间结构解析 X射线衍射(X-ray diffraction)和核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)技术是研究蛋白质三维空间结构的经典方法。X射线衍射法需要首先将蛋白质制备成晶体，X射线射至蛋白质晶体上，产生不同方向的衍射，收集衍射光束所产生的电子密度图，可计算出空间结构。核磁共振技术主要用于测定蛋白质的液相三维空间结构。
冷冻电镜 (cryo-electron microscopy) 技术的发明极大提高了蛋白质三维结构的解析速度和分辨率，而且可以分析蛋白质在相对天然状态下的结构，当前已经成为结构生物学的主要研究手段。
3、生物信息学预测蛋白质空间结构 由于蛋白质空间结构的基础是一级结构，参照已经完成的各种蛋白质的三维结构数据库，已经可以初步预测各种蛋白质的三维空间结构。