生物化學與分子生物學/分子雜交和印跡技術

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常用的分子生物學技術及其應用 - 分子雜交和印跡技術 - PCR技術的原理與應用 - DNA測序技術 - 生物芯片技術 - 蛋白質的分離、純化與結構分析 - 生物大分子相互作用研究技術
分子雜交技術利用DNA變性與復性這一基本理化性質,結合印跡技術和探針技術,可進行DNA和RNA的定性或定量分析。

分子雜交和印跡技術的原理[編輯]

印跡技術[編輯]

1975年,E. Southern將經瓊脂糖電泳分離的DNA片段在膠中變性使其成為單鏈,然後將硝酸纖維素(nitrocellulose, NC)膜平鋪在膠上,膜上放置一定厚度的吸水紙巾,利用毛細作用使膠中的DNA分子轉移到NC膜上,使之固相化。將載有DNA單鏈分子的NC膜放在核酸雜交反應溶液中,溶液中具有互補序列的DNA或RNA單鏈分子就可以結合到存在於NC膜上的DNA分子上。這一技術類似於用吸墨紙吸收紙張上的墨跡,因此稱之為"blotting" , 譯為印跡技術。目前這種技術已廣泛用於DNA、RNA和蛋白質的檢測。除靠毛細作用將DNA轉移至NC膜外,後來又建立了電轉移印跡技術 和真空吸引轉移印跡技術。這些新的方法縮短了轉移所需的時間。另外亦有一些新的材料用千轉移膜製備而改善待測分子的轉移效率和樣品承載能力。

探針技術[編輯]

探針(probe)指的是帶有放射性核素、生物素或熒光物質等可檢測標誌物的核酸片段,它具有特定的序列,能夠與待測的核酸片段依據鹼基互補原理結合,因此可以用於檢測核酸樣品中存在的特定核酸分子。核酸探針既可以是人工合成的寡核苷酸片段,也可以是基因組DNA片段、cDNA全長或片段,還可以是RNA片段。在NC膜雜交反應中,標記探針的序列如果與NC膜上的核酸存在鹼基序列互補,就可以結合到膜上的相應DNA或RNA區帶,經放射自顯影或其他檢測手段就可以判定膜上是否有互補序列的核酸分子存在。

印跡技術的類別及應用[編輯]

印跡技術可以分為DNA印跡、RNA印跡和蛋白質印跡三大類。

DNA印跡[編輯]

DNA 印跡(DNA blotting) 為E. Southern 首次應用,因而命名為 Southern blotting。DNA 樣品經限制性內切酶消化後行瓊脂糖凝膠電泳分離 DNA 片段,將含有不同大小 DNA 片段的凝膠在變性溶液中處理,然後將膠中的變性 DNA 分子轉移到 NC 膜上,轉移完成後,將含 DNA 片段的 NC 膜在80℃真空條件下加熱或在紫外交聯儀內處理,使 DNA 固定於 NC 膜上,即可用於雜交反應。DNA 印跡技術主要用於基因組 DNA 的定性和定量分析,例如對基因組中特異基因的定位及檢測、基因組中轉基因和基因剔除的分析,此外亦可用於分析重組構建的質粒和噬菌體。

RNA印跡[編輯]

利用與 DNA 印跡相類似的技術來分析RNA就稱為 RNA 印跡(RNA blotting)。相對於 Southern blotting, 有人將 RNA 印跡稱為 Northern blotting, 其技術原理與 Southern blotting 相同。RNA 分子較小,在轉移前無需進行限制性內切酶切割,而且變性 RNA 的轉移效率也比較高。RNA 印跡技術目前主要用於檢測特定組織或細胞中已知的特異 mRNA 和非編碼 RNA 的表達水平,也可以比較不同組織和細胞中的同一基因的表達情況。儘管用 RNA 印跡技術檢測 RNA 的敏感性較 PCR 法低,但是由於其特異性強,假陽性率低,仍然被認為是最可靠的 mRNA 和非編碼 RNA 定量分析方法之一。

蛋白質印跡[編輯]

印跡技術不僅可用於核酸的分子雜交,而且也可用於蛋白質的分析。人們發現蛋白質在電泳之後也可以從膠中轉移並固定到膜型材料上,再依靠與溶液中相應的蛋白質分子相互結合來進行定性定量分析,其中最常用的是用抗體來檢測,因此亦被稱為免疫印跡 (immunoblotting) 。相對應於DNA 的 Southern blotting 和 RNA 的Northern blotting, 蛋白質印跡被稱為Western blotting。
蛋白質印跡需先將混合蛋白質用聚丙烯醯胺凝膠電泳按分子大小分開,再將蛋白質轉移到 NC膜或其他膜上。蛋白質的轉移只有靠電轉移方可實現。蛋白質的分析主要靠抗體來進行。特異性抗體(成為第一抗體)首先與轉移膜上相應的蛋白質分子結合,然後用鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶標記或放射性核素標記的第二抗體與之結合。反應之後用底物顯色或放射自顯影來檢測蛋白質區帶的信號,底物亦可與化學發光劑相結合以提高敏感度。蛋白質印跡技術用於檢測樣品中特異性蛋白質的存在、細胞中特異蛋白質的半定量分析以及蛋白質分子的相互作用研究等。
除上述三種基本印跡技術外,還有一些方法可用於核酸和蛋白質的分析。例如,可以不經電泳分 離而直接將樣品點在 NC 膜上用於核酸雜交分析,這種方式被稱為斑點印跡 (dot blotting) ; 組織切片或細胞塗片可以直接用於雜交分析,稱為原位雜交(in situ hybridization, ISH);可以將多種已知序列的 DNA 排列在一定大小的尼龍膜或其他支持物上用於檢測細胞或組織樣品中的核酸種類,這種技術稱為 DNA 芯片技術