生物化学与分子生物学/分子杂交和印迹技术
常用的分子生物学技术及其应用 -
分子杂交和印迹技术 -
PCR技术的原理与应用 -
DNA测序技术 -
生物芯片技术 -
蛋白质的分离、纯化与结构分析 -
生物大分子相互作用研究技术
分子杂交技术利用DNA变性与复性这一基本理化性质，结合印迹技术和探针技术，可进行DNA和RNA的定性或定量分析。
分子杂交和印迹技术的原理
[编辑]印迹技术
[编辑]1975年，E. Southern将经琼脂糖电泳分离的DNA片段在胶中变性使其成为单链，然后将硝酸纤维素(nitrocellulose, NC)膜平铺在胶上，膜上放置一定厚度的吸水纸巾，利用毛细作用使胶中的DNA分子转移到NC膜上，使之固相化。将载有DNA单链分子的NC膜放在核酸杂交反应溶液中，溶液中具有互补序列的DNA或RNA单链分子就可以结合到存在于NC膜上的DNA分子上。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为"blotting" , 译为印迹技术。目前这种技术已广泛用于DNA、RNA和蛋白质的检测。除靠毛细作用将DNA转移至NC膜外，后来又建立了电转移印迹技术 和真空吸引转移印迹技术。这些新的方法缩短了转移所需的时间。另外亦有一些新的材料用千转移膜制备而改善待测分子的转移效率和样品承载能力。
探针技术
[编辑]探针(probe)指的是带有放射性核素、生物素或荧光物质等可检测标志物的核酸片段，它具有特定的序列，能够与待测的核酸片段依据碱基互补原理结合，因此可以用于检测核酸样品中存在的特定核酸分子。核酸探针既可以是人工合成的寡核苷酸片段，也可以是基因组DNA片段、cDNA全长或片段，还可以是RNA片段。在NC膜杂交反应中，标记探针的序列如果与NC膜上的核酸存在碱基序列互补，就可以结合到膜上的相应DNA或RNA区带，经放射自显影或其他检测手段就可以判定膜上是否有互补序列的核酸分子存在。
印迹技术的类别及应用
[编辑]印迹技术可以分为DNA印迹、RNA印迹和蛋白质印迹三大类。
DNA印迹
[编辑]DNA 印迹(DNA blotting) 为E. Southern 首次应用，因而命名为 Southern blotting。DNA 样品经限制性内切酶消化后行琼脂糖凝胶电泳分离 DNA 片段，将含有不同大小 DNA 片段的凝胶在变性溶液中处理，然后将胶中的变性 DNA 分子转移到 NC 膜上，转移完成后，将含 DNA 片段的 NC 膜在80℃真空条件下加热或在紫外交联仪内处理，使 DNA 固定于 NC 膜上，即可用于杂交反应。DNA 印迹技术主要用于基因组 DNA 的定性和定量分析，例如对基因组中特异基因的定位及检测、基因组中转基因和基因剔除的分析，此外亦可用于分析重组构建的质粒和噬菌体。
RNA印迹
[编辑]利用与 DNA 印迹相类似的技术来分析RNA就称为 RNA 印迹(RNA blotting)。相对于 Southern blotting, 有人将 RNA 印迹称为 Northern blotting, 其技术原理与 Southern blotting 相同。RNA 分子较小，在转移前无需进行限制性内切酶切割，而且变性 RNA 的转移效率也比较高。RNA 印迹技术目前主要用于检测特定组织或细胞中已知的特异 mRNA 和非编码 RNA 的表达水平，也可以比较不同组织和细胞中的同一基因的表达情况。尽管用 RNA 印迹技术检测 RNA 的敏感性较 PCR 法低，但是由于其特异性强，假阳性率低，仍然被认为是最可靠的 mRNA 和非编码 RNA 定量分析方法之一。
蛋白质印迹
[编辑]印迹技术不仅可用于核酸的分子杂交，而且也可用于蛋白质的分析。人们发现蛋白质在电泳之后也可以从胶中转移并固定到膜型材料上，再依靠与溶液中相应的蛋白质分子相互结合来进行定性定量分析，其中最常用的是用抗体来检测，因此亦被称为免疫印迹 (immunoblotting) 。相对应于DNA 的 Southern blotting 和 RNA 的Northern blotting, 蛋白质印迹被称为Western blotting。
蛋白质印迹需先将混合蛋白质用聚丙烯酰胺凝胶电泳按分子大小分开，再将蛋白质转移到 NC膜或其他膜上。蛋白质的转移只有靠电转移方可实现。蛋白质的分析主要靠抗体来进行。特异性抗体（成为第一抗体）首先与转移膜上相应的蛋白质分子结合，然后用碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶标记或放射性核素标记的第二抗体与之结合。反应之后用底物显色或放射自显影来检测蛋白质区带的信号，底物亦可与化学发光剂相结合以提高敏感度。蛋白质印迹技术用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。
除上述三种基本印迹技术外，还有一些方法可用于核酸和蛋白质的分析。例如，可以不经电泳分 离而直接将样品点在 NC 膜上用于核酸杂交分析，这种方式被称为斑点印迹 (dot blotting) ; 组织切片或细胞涂片可以直接用于杂交分析，称为原位杂交(in situ hybridization, ISH）；可以将多种已知序列的 DNA 排列在一定大小的尼龙膜或其他支持物上用于检测细胞或组织样品中的核酸种类，这种技术称为 DNA 芯片技术